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【讨论】分享一些做TUNEL 的经验,大家做类似实验的，如果有一些细节的问题，欢迎提问。
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这个帖子发布于4年零270天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
为了感谢丁香园对我的帮助，我想分享一下我做TUNEL的经验。刚开始，我做TUNEL，全部是假阳性，非常着急，到处找原因，最后是丁香园帮助了我，我很感谢，尤其是bluetoad的建议，让我有了成功的TUNEL结果。分享一下我的经验。首先说明我用的是Roche 的TUNEL红色荧光试剂盒，TMR, 是胎鼠脑袋的冰冻切片，漂片处理，与DAPI， Nestin共染。见附件图。我的两点心得，就是:第一，切片一定要新鲜的，最好新切新用，如果切片已经放在4度超过一个星期，就千万别用了；第二，Tunel染色后，漂洗要透彻。大家做类似实验的，如果有一些细节的问题，欢迎提问。
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letianpai1990 你好～～主要是两方面原因～一是最近实验室的荧光显微镜坏了～另一方面是想说DAB显色，再苏木素复染能否也说明问题，因为我们荧光的非特异好高，而且按照说明书上的步骤来说荧光和DAB可以在同张片子上显示，它俩是不是并列的关系，都可以说明凋亡？初学者～所以好多不懂了～～谢谢！1、只要是试剂盒信号可以进行DAB显色，没有问题。2、不建议荧光和DAB放在一起做，一是没必要，二是荧光非特异性会提高。3、不能叫并列关系，其实就是一个凋亡信号观察方式不一样而已。
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楼主您好我也正在做此实验，已经在镜下照相，想请问一下，您的结果是如何处理的，直接在镜下数细胞核吗？还是应用什么软件呢？谢谢~~
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我用的是zen软件，先把图片输出为DAPI 和 TUNEL 共定位的图片，因为我使用40倍镜拍的，所以很清晰，TUNEL细胞因为不多，可以直接数，但是DAPI染的细胞很多，我使用了软件来数，用的是Image-pro plus 7.0，祝你好运
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楼主你好，我最近要杀老鼠，杀完要做组织TUNEL，之前一直没有接触过这个，很陌生，有一些问题要请教一下，1 做细胞凋亡，石蜡切片和冰冻切片有什么区别？2 我做的是甲状腺，如果做TUNEL，大概需要多少组织量？3 检测的切片有时间限制吗？谢谢啊
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石蜡切片要复杂一些，需要脱蜡，再水化等步骤，冰冻切片可以直接做，后续步骤基本相同，只是石蜡切片处理要多一些。具体要看不同公司提供的TUNEL Kit 的说明书。我没有做过甲状腺的TUNEL，但是我想只要可以做成切片则可，还要看你的实验目的，比如，你需要统计不同处理的Sample是否有TUNEL 细胞的区别，那你就需要多一些的片子，已达到统计的量。无论是哪一种切片，都需要新鲜切片，不要放4度过长的时间，否则会有很多的假阳性。
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谢谢楼主了
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0.1% Triton X–100 in 0.1% sodium citrate。请问楼主是怎么配制的？？
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我用PBS来配的，比如一升的溶液。一升的PBS，加入1克的sodium citrate，再加入1毫升的Triton X–100 ，充分混匀
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楼主，您好！最近我也在做TUNEL，您说漂洗要彻底，您一般洗的力度是多少？我看罗氏的说明书上是2*2min，我按照说明做的，但感觉有好多假阳性。谢谢你~~
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楼主你好，我准备做大鼠大脑皮层的TUNEL，不知道取材后可否放于装有多聚甲醛的冻存管内然后直接置于-80冰箱保存，待一个月左右做冰冻切片呢
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我也是啊，罗氏的，3次*5min，背景还很高呢
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请问楼主，做tunel的标本有什么要求，我要做大鼠肝组织的，如果标本在-80度冰箱放超过2个月还能用吗？
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请教楼主，测细胞悬液中的凋亡细胞，用tunel好还是Annexin V /PI 好啊？正在学习中，请多指教，非常感谢！
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三次5min清洗，力度不够，我基本是10min*4清洗
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Jeremy2王 edited on
在-80度保存前，最好先固定，用4%甲醛，然后脱水，PBS配的30%蔗糖脱水两到三天，也可以先20%脱水，再30%脱水，我都试过，区别不大。然后用O.C.T固定，固定好放-80，几个月都问题。
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如果你的标本是新鲜冻的，或者固定好立刻冻的，应该没问题，就是要避免组织在室温或者0到4度时间过长，因为内源的核酸酶降解DNA会造成假阳性
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好帖子啊 我也准备做
以后多多指教
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请问楼主：1×PBS指的是0.1mol/L还是0.2mol/L
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另外再请教楼主一个问题:有的文献上说大脑中动脉供血范围是额顶叶、颞叶、基底节、丘脑，而翻阅园子里的帖子说供血范围应该是顶叶、颞叶、纹状体，我做的是MCAO再灌注模型石蜡切片tunel检测，到底应该切哪几个层面呢？谢谢！
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请教楼主，我用博士德做的，严格按说明来做，可是满视野全是棕黄色的细胞，这种非特异性染色问题会出在哪？谢谢
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请教各位一下，罗氏的TUNEL检测试剂盒中酶浓缩液是10×的，是否需要稀释，稀释用何种稀释液？？
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你好，请问，我用的是罗氏公司的tunel荧光法，小鼠视网膜冰冻切片。最先做了几次阳参都背景过高，后来加了封闭一步，用甲醇，双蒸水，30%H2O2，8:1:1进行封闭，结果不错。但是这次再做背景仍然过高，能帮我分析一下吗？阳参成功那次我用的是新鲜的切片，不成功的几次都是不新鲜的切片，这个对阳参会有影响吗？PBS冲洗应该怎么洗啊，我都是放在摇床上30min,这样会不会有影响啊
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亲爱的同志门，我准备做肝组织的石蜡切片测细胞凋亡，买了罗氏的试剂盒，想请问几个问题，1：蛋白酶K工作液怎么配制？可否用PBS配？2：用蛋白酶K处理了的组织是不是可以不再用Triton X-100处理组织？3：用3%的过氧化氢甲醇处理组织是在蛋白酶K处理组织之前还是之后一步啊？我看到有不同版本。我现在确实找不到方向了，所以请各位多多帮助，非常感谢
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你好, 我买的是罗氏这个tunel试剂盒,用卵巢石蜡切片做凋亡,看说明书上没有复染这一步,请问一下复染是否必要,可否选用dapi复染?
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楼主，我做大鼠脊髓的冰冻切片，用的是南京凯基的试剂盒，蓝光下看连阳性对照都没做出来，是什么原因啊？
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莫瑾 楼主，我做大鼠脊髓的冰冻切片，用的是南京凯基的试剂盒，蓝光下看连阳性对照都没做出来，是什么原因啊？老兄是南京的嘛？如果步骤没有问题，建议你能不能借几十ul进口的试1-2张片子。国产的有些不知道他好不好，我都不敢用。
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金屋不敢藏娇 老兄是南京的嘛？如果步骤没有问题，建议你能不能借几十ul进口的试1-2张片子。国产的有些不知道他好不好，我都不敢用。 我在无锡，而且我不是用的进口的啊
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楼主你好，请问做TUNEL，组织取材需要生理盐水、甲醛灌注吗？有影响吗
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请问楼主，我要做大鼠肠组织的，做tunel的标本有什么要求，我有石蜡标本和在-80度冰箱放超过3个月的标本，还能用吗？
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金屋不敢藏娇 老兄是南京的嘛？如果步骤没有问题，建议你能不能借几十ul进口的试1-2张片子。国产的有些不知道他好不好，我都不敢用。TUNEL检测还是建议用进口产品，如果在上海地区可以提供少量分装试用。
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feedoctor 请问楼主，我要做大鼠肠组织的，做tunel的标本有什么要求，我有石蜡标本和在-80度冰箱放超过3个月的标本，还能用吗？标本固定完好即可，可以使用。
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石蜡切片要复杂一些，需要脱蜡，再水化等步骤，冰冻切片可以直接做，后续步骤基本相同，只是石蜡切片处理要多一些。具体要看不同公司提供的TUNEL Kit 的说明书。我没有做过甲状腺的TUNEL，但是我想只要可以做成切片则可，还要看你的实验目的，比如，你需要统计不同处理的Sample是否有TUNEL 细胞的区别，那你就需要多一些的片子，已达到统计的量。无论是哪一种切片，都需要新鲜切片，不要放4度过长的时间，否则会有很多的假阳性。你好～～我想问下～我们做石蜡切片的TUNEL，用的博士德的试剂盒～～说明书上写着荧光照相后加DAB显色～～一张片子可以用两种方式观察～～那我想问下我能不能只做DAB不照荧光 能说明问题吗？
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letianpai1990 你好～～我想问下～我们做石蜡切片的TUNEL，用的博士德的试剂盒～～说明书上写着荧光照相后加DAB显色～～一张片子可以用两种方式观察～～那我想问下我能不能只做DAB不照荧光 能说明问题吗？既然荧光拍照记录信号了为何还要dab显色?有必要吗?选择其一做即可。
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letianpai1990 你好～～我想问下～我们做石蜡切片的TUNEL，用的博士德的试剂盒～～说明书上写着荧光照相后加DAB显色～～一张片子可以用两种方式观察～～那我想问下我能不能只做DAB不照荧光 能说明问题吗？既然荧光拍照记录信号了为何还要dab显色?有必要吗?选择其一做即可。你好～～主要是两方面原因～一是最近实验室的荧光显微镜坏了～另一方面是想说DAB显色，再苏木素复染能否也说明问题，因为我们荧光的非特异好高，而且按照说明书上的步骤来说荧光和DAB可以在同张片子上显示，它俩是不是并列的关系，都可以说明凋亡？初学者～所以好多不懂了～～谢谢！
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letianpai1990 你好～～主要是两方面原因～一是最近实验室的荧光显微镜坏了～另一方面是想说DAB显色，再苏木素复染能否也说明问题，因为我们荧光的非特异好高，而且按照说明书上的步骤来说荧光和DAB可以在同张片子上显示，它俩是不是并列的关系，都可以说明凋亡？初学者～所以好多不懂了～～谢谢！1、只要是试剂盒信号可以进行DAB显色，没有问题。2、不建议荧光和DAB放在一起做，一是没必要，二是荧光非特异性会提高。3、不能叫并列关系，其实就是一个凋亡信号观察方式不一样而已。
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关于丁香园关注今日：9 | 主题：139581
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【求助】组织TUNEL染色
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问题已关闭悬赏丁当:2
我想给小鼠肝脏组织做TUNEL染色，可罗氏光染料就有4-5种，不知大家推荐哪个，荧光还是非荧光的？POD还是AP、TMR red？？谢谢
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产品名称： 罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称： Tunel产品货号： 产品规格： 50T试剂级别： 试剂级产品产地： USA产品商标： RocheIn situ cell death detection kit-POD法 一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、 器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。三、 实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；5. PBS漂洗2次；6. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。11. PBS漂洗3次；12. 在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100（见备注5）中处理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6—15四、 注意事项1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7. 荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
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我也正在纠结，roche还是国产的凯基试剂盒？roche比凯基贵好多，就是不知道效果会怎样？
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那还是罗氏好很多啊，做一次这么麻烦干嘛不用好点的呢
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可以选择使用Biotium公司的Tunel试剂盒，是荧光法的 效果非常的好，价格也有优势，如果有需要可以联系《上海开放生物》-Biotium中国总代理，另外还有生物素标记的dUTP试剂（包括不同连接臂长度的产品），可以为您的实验提供更多的选择性，希望可以帮到您！
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你好，最近准备做小鼠肝组织的TUNEL（POD），请问你当时用的是蛋白酶K吗？作用浓度、温度和时间各是多少?期待楼主和其他小伙伴的解答，谢谢！
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关于丁香园【求助】组织TUNEL染色
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