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基因工程的酶学基础
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第一章绪论1、基因：就是存在于DNA上承载遗传信息的核苷酸序列，是位于染色体上呈直线排列的遗传物质的最小单位，也是携带遗传信息的结构单位和控制遗传性状的功能单位。2、基因工程：又称重组DNA技术，分子水平进行遗传操作，将任何生物体（供体）的基因或基因组提出来，或通过人工合成的，按照先设置好的蓝图，插入质粒或复制子（载体），而形成一杂合分子（DNA重组体），然后将重组体转移到复制子所属的生物体复制，或转移到另一生物体（受体）的细胞内（原核或真核），使之在内遗传并使受体细胞获得新的性状。3、基因工程的三要素：供体、载体、受体4、基因工程的基本流程：（1）DNA的制备包括从供体生物的基因组分离或人工合成，以获得带有的DNA片段。 （2）在体外通过限制性核酸内切酶分别分离得到的外源DNA和载体分子进行定点切割，使之片段化或线性化（3）在体外将含有外源基因的不同来源的DNA片段通过到载体分子上，构建重组DNA分子。（4）将重组DNA分子通过一定的方法引入到进行扩增和表达，从培养细胞中获得大量细胞繁殖群体。（5）筛选和鉴定转化细胞，剔除非必需重组体，获得引入的外源基因稳定高效表达的基因或细胞，即将所需要的阳性克隆挑选出来。（6）将选出的细胞克隆的基因进一步分研究，并设法使之实现功能蛋白的表达。
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第三章 基因工程工具酶1、基因工程中常用的工具酶：限制酶、连接酶、聚合酶、修饰酶2、细菌的限制—修饰系统（简称R—M体系）：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性，构成了寄主控制的限制—修饰系统R-M体系说明的问题和作用：R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。个别在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。3、限制性内切酶的切割方式（识别哪种末端）（1）平齐末端：（切割位点在识别序列中心轴处）&&（2）5’黏性末端：（DNA片段末端的5’端比3’端长） （3）3’黏性末端：（DNA片段末端的3’端比5’端长） 4、判断同裂酶和同尾酶（1）同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割C CGG。（2）同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。如BamHⅠ、Bcl Ⅰ和Bgl5、限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算举例：识别序列A&&&& DNA分子各种可能出现的序列为A、G、C、T 则识别序列出现的几率为1/4&&& (1/4n,n为识别序列的个数)6、（不是概念题）能利用NAD+或中的能量，催化多段DNA的3’羟基和5’末端之间形成3’,5’—磷酸二酯键。7、DNA聚合酶&&&& 聚合作用5’-3’&&&& 外切酶活性3’-5’&&&& 外切酶活性5’-3’DNA聚合酶Ⅰ&&&& +&&&& +&&&& +Klenow片段&&&&&&&&&& +&&&& +&&&& —T7DNA聚合酶&&&& +&&&& +&&&& —反转录酶&&&& +&&&& —&&&& —TaqDNA聚合酶&&&& +&&&& —&&&& +具有标记探针的酶：DNA聚合酶Ⅰ、Klenow片段
第四章一、核酸的提取1、碱裂解法抽提质粒DNA原理：在PH值介于12.0—12.5的条件下加热DNA溶液，线性DNA会变性，而闭合环状DNA不会变性，若用至冷的或恢复中性的方法处理DNA混合物，质粒DNA能迅速而准备的复性，但随性断裂发生的线性染色体DNA分子彼此已经分开的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来，可用酒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA.2、琼脂糖凝胶电泳影响其迁移率的因素：①DNA的分子大小②琼脂糖浓度③DNA分子的构象④电源电压⑤嵌入染料的存在⑥离子强度影响⑦电场方向3、聚合酶链式反应（PCR）: 定义：基本原理：PCR是一种体外核酸扩增技术，是以待增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促反应特异DNA片段的方法，目的基因DNA在高温（940C）下解链成为单链模板，人工合成的一对目的基因两侧序列向互补的寡聚核苷酸引物在低温（40—600C）分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合，在中等温度（65—750C）下由耐热DNA聚合酶（Taq酶）将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5’-3’方向延伸，合成一条新的互补链，经变性、退火、延伸三个步骤反复循环，使DNA扩增。DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94&& C&&退火（annealing）:40 C&& ~60 C 延伸（extension）:72&& C PCR体系的主要组分：DNA模板、引物、底物dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液4、测序方法Sanger双脱氧链终止法（P83注意该法的图样，能识别序列，知道序列是怎样得到）原理：①DNA复制：模板DNA、DNA聚合酶、引物、4种dNTP ②ddNTP的加入：在反应系统中加入双脱氧（碱基）核苷三磷酸（ddNTP），只要双脱氧核苷酸掺入3’ 端，该链就停止延伸，链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延伸。如此得到3’端终止于ddNTP的一系列长度不等的核酸片段③4个反应体系中分别加入4种不同的ddNTP，浓度低于dNTP。反应终止后，分四个泳道进行电泳（聚丙烯酰胺凝胶），分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
5、基因文库：是指某种生物的全部基因的随机片断的重组DNA的克隆群体6、cDNA文库：是生物体某一特定发育时期所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成克隆的**。7、基因文库与cDNA文库的区别：cDNA文库具有时效性，是某一个发育时期，特定环境下，mRNA上信息的体现，不含有内含子序列及其他调控序列。cDNA文库只反映mRNA的分子结构，cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，cDNA并不真正意义上的基因。基因组文库可真实的显示基因组的全部遗传信息。8、基因文库构建的基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②载体的选择和制备。③DNA片段或cDNA与载体连接。④重组体转化宿主细胞。⑤转化细胞的筛选。9、考虑基因文库的完备性(P表示某一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f代表克隆片段的平均大小与生物基因组的大小比值)P8810、（1）DNA与蛋白质相互作用的方法：凝胶阻滞法、DNaseⅠ足迹法&&& （2）蛋白质与蛋白质相互作用的方法：酵母双杂交技术、噬菌体表面呈现技术
第五章&& 1、克隆载体必须具备的条件：①在宿主细胞内能够自主复制&&&& ②具备合适的单一酶切位点③有一定的选择标记&&&&& ④较高的&&&& ⑤具有较高的稳定性2、质粒克隆载体的构建(1)pBR322 质粒&&&& 大小为 4361bp ， 含有 30 多个单一位点，具有抗性基因（tetr）和抗性基因（ampr），其质粒复制区来自 pMB1。利用抗性基因内部的 BamHⅠ 位点来插入外源 DNA 片段，可通过插入失活进行筛选。 (2) pUC18 和 pUC19（1） pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，由 pBR322 改造而来，具有抗性基因，一个复制起始点，复制子为Col EI（2）两者的差异：这两个质粒的结构只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 3、蓝白斑筛选：载体上有一段β-半乳糖苷酶（LacZ）的α片段（），其上有外源DNA的插入位点（不破坏读码框）。受体菌基因组中有突变的β-半乳糖苷酶基因（α片段缺失）。可以被IPTG（含硫的乳糖类似物）诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。通过在培养基中涂X-gal即可筛选。P1634、（1）几种克隆载体：载体、Cosmid克隆载体、M13噬菌体克隆载体（2）以上克隆载体的在载量：载体: 48kb&&&&&&&&&&&&&&Cosmid克隆载体：45kb&&&&&& M13噬菌体克隆载体：1.5kb5、Cosmid克隆载体（结构）（1）柯斯质粒是由DNA的cos位点序列和质粒的复制子所组成，具有质粒和λ噬菌体的双重特征。所以称为cosmid.意思是指带有黏性末端cos的质粒。6、大分子载体（1）酵母人工染色体（YAC）：YAC的结构①着丝粒(CEN)②(TEL)③酵母ARS序列⑤酵母选择标记
第六章&& 的分离与克隆1、基因的分离和克隆的步骤①选择富含的生物试料②选择合适的方法制备DNA片段并克隆③选择合适的方法筛选目的基因。2、的间接克隆（1）依据基因部分序列信息获取基因全长序列的策略①5’ RACE Ⅰ、在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始第一条链的合成Ⅱ、RNase混合物降解模板mRNA，纯化第一条链。 Ⅲ、用末端转移酶在链3‘端加入连续的dCTP Ⅳ、以连有(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行，以期得到目的片段，并可用nest PCR进行检测。② 3’RACEⅠ、是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的(dT)的锚定引物启始第一条链的合成。Ⅱ、用RNaseH 降解模板mRNA。Ⅲ、用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行得到目的3‘片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增。&&& 3、&& 问题：基于EST系列用 5’ RACE、3’RACE求 全长)P139EST可结合PCR技术进行基因克隆。经电子杂交筛选后的EST及其延伸产物序列可作为某一基因的标签，并进一步克隆新的基因。首先依据该标签序列提供的信息设计并合成基因特异引物（GSP），在对mRNA进行反转录的同时加上锚定引物，然后采用RACE技术求全长。4、的构建的过程①高分子量染色体DNA的制备；②体外重组边接；③包装蛋白的制备；④重组体的体外包装；⑤将重组DNA导入寄主细胞；⑥筛选
第七章 基因的体外重组和转化1、DNA片段的体外连接方式：黏性末端的连接、平头末端的连接、修饰黏性末端的连接 2、衔接物连接法原理（148—149）：衔接物是指用化学方法合成的一段由8～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。3、感受态细胞：经过一些特殊方法的处理后，的通透性发生了暂时性的改变，成为容易接受外源DNA分子进入的状态，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。
&&&&& 第八章&&& 重组体的筛选和鉴定1、重组体的筛选：检测法、 DNA电泳法检测、核酸分子杂交检测、 类检测法、 转译筛选法 2、插入失活筛选原理：外源DNA插入载体特定部位（一般为抗性基因或选择性），引起载体原有功能改变； 例子（P160-161）——以质粒pBR322介导的重组子筛选：质粒pBR322编码有两个抗生素抗性基因，一个抗性基因和一个抗基因，如果外源DNA片段插入 pBR322的BamHⅠ位点，则在破坏了Tetr的表达，重组质粒不在具有四环素抗性，而只具有氨苄青霉素抗性。重组质粒转化的细菌在含有Amp的选择培养基固体平板上能够生长，但不能在含有Tet的培养基上生长。将转化细菌涂布培养在Amp培养基固体平板上后，能够生长的则具有Amp抗性，表明这些细菌中含有pBR322质粒，说明转化成功。而没有转入质粒pBR322的细菌由于没有Amp抗性，不能在Amp培养基上能生长。3、DNA电泳法检测包括酶切鉴定和PCR检测4、核酸分子杂交检测原理：具有一定的两条核酸单链在适宜的温度及条件下，按碱基互补配对复性形成双链。5、检测方法：放射免疫法、 （有大题就是利用以上方法进行筛选重组子至少两种或两种以上）第九章&&& 克隆基因的表达与产物的检测1、克隆基因在中的表达调控（了解）2、穿梭载体：是指能够在两类不同宿主细胞中复制、增殖的载体。主要是质粒载体。3、克隆基因在中的表达调控真核生物的层次：（具体怎么调控自己整理）(重要题)①、DNA水平调节②、转录水平调节③、转录后水平的调节④、翻译水平的调控⑤、翻译后水平调节4.转化植物的方法：介导、、花粉管通道、、子房注射等。
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