实时荧光定量PCR具体实验步骤2
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实时荧光定量PCR具体实验步骤2
4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
序号& 反应物& 剂量
1&& SYBR Green 1 染料& 10μl
2& 阳性模板上游引物F& 0.5μl
3& 阳性模板下游引物R& 0.5μl
4& dNTP& 0.5μl
5& Taq酶& 1μl
6& 阳性模板DNA& 5μl
7& ddH2O& 32.5μl
8& 总体积& 50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
序号& 反应物& 剂量
1& SYBR Green 1 染料& 10μl
2& 内参照上游引物F& 0.5μl
3& 内参照下游引物R& 0.5μl
4& dNTP& 0.5μl
5& Taq酶& 1μl
6& 待测样品cDNA& 5μl
7& ddH2O& 32.5μl
8& 总体积& 50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
序号& 反应物& 剂量
1& 10× PCR缓冲液& 2.5 ul
2& MgCl2 溶液& 1.5 ul
3& 上游引物F& 0.5 ul
4& 下游引物R& 0.5 ul
5& dNTP混合液& 3 ul
6& Taq聚合酶& 1 ul
7& cDNA& 1 ul
8& 加水至总体积为& 25ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6 待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：
序号& 反应物& 剂量
1& SYBR Green 1 染料&& 10 ul
2& 上游引物& 1ul
3& 下游引物& 1ul
4& dNTP&& 1ul
5& Taq聚合酶& 2ul
6& 待测样品cDNA& 5ul
7& ddH2O&& 30ul
8& 总体积& 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
7 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier
5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA
Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView?染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
wangminchao
[2] & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
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请问做实时荧光定量PCR实验时,为什么做标准曲线?
强颜欢笑丶炋v
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1 做标曲才可以算出这对引物的扩增效率（其斜率）,方便用pfaffl方法来进行相对定量（得到的结果相对精确一点）,否则只能默认扩增效率为2,用2^-ddCt(Livak)法来计算2 做标曲才可以绝对定量.
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绝对定量和相对定量都可以做标准曲线，目的在于用已知浓度样品的量做成的标准曲线来定未知浓度样品的量。
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