请问分开两条相差100BP的条带电泳条件(条带,电泳,目的条带,切胶回收) - PCR实验 - 生物秀
标题: 请问分开两条相差100BP的条带电泳条件(条带,电泳,目的条带,切胶回收)
摘要: [请问分开两条相差100BP的条带电泳条件(条带,电泳,目的条带,切胶回收)] 我扩增的目的条带为800多bp，但出现了一些无法去处了非特异性条带，有一条在900bp左右。我想跑电泳切胶回收，那么用浓度为多少的胶和多大的电压比较合适呢？ 关键词:[条带 电泳 目的条带 切胶回收 跑电泳 非特异性]……
我扩增的目的条带为800多bp，但出现了一些无法去处了非特异性条带，有一条在900bp左右。我想跑电泳切胶回收，那么用浓度为多少的胶和多大的电压比较合适呢？
分离100bp差异的条带，我用过100v,2%的胶，时间长一些，能很清晰的分开100v会不会太高了啊，很快就跑完了啊我用过100v, 1.7%的胶，大约70 - 80分钟，分开50bp的条带, 效果很好.可是电泳槽的长度有限，怎么能够跑那么长时间呢你可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度3.5%-5.0%，电压80-100v，半个小时差不多。胶浓度越大分辨率越高，分的越清，但跑的时间可能长点。你可以用差异显示用的大长胶板跑聚丙烯酰胺胶，可以跑一个多小时就能分开100bp的条带。好的，谢谢大家，我去试试你可以用30V、2%的胶试试！30-60min。1．可以用非变性PAGE胶电泳，应该能分开的，理论上说分辨率达到1个碱基。可以用非变性丙烯酰胺凝胶电泳进行分离鉴定NA在丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围:丙烯酰胺(W/V):12% 有效分离范围(bp):40-20015% 25-150电压一般是1-8V/cm, 6个小时后银染即可分辨你的两个片段2．可以用1.3%TAE的长胶，在30伏的电压下（中号电泳槽），跑16-20小时是应该可以分开的。3．用2.5%的琼脂糖就能分开，我们实验室经常用它来分开相差28bp的片段，效果很好，看的很清楚，但有几点要注意，缓冲液要是新配的，电压100v跑10分钟，接着50v跑一个 半小时，到两个小时。 4．理论上用1.5或者2.5琼脂糖应该都可以分开，在电泳的时候电压不适宜太大，用40-50v跑上2小时左右应该就可以了。电压加大到80v或者100v的时候虽然节省实验时间，但是有时条带的效果看起来就不是很好。还有就是似乎你的Marker选择的不好，即使电泳能够分开两条带，这个Marker也很难来说明你的目的条带和内参带的大小。5．用聚丙烯酰胺跑垂直电泳。1。需要单独的垂直电泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝胶。2，具体的做法可以到 谷 网站，有详细的说明。3，你可以用5%的糖跑一下。6．建议你跑PCR的时候做个阴性对照，只加引物，电泳时看阴性对照引物二聚体的位置，以区分拟订目的片段71bp条带，或是电泳时直接加一空引物做对照请问用那多大的胶，回收产物的效率和纯度还会高么？？？
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1.75亿学生的选择
当两条碱基数相差不大(比如50bp)的双链dna分子混在一起时,将采用什么措施分离?用琼脂糖电泳怎么弄?
负心帝NO06Z
1.尽量用浓度较低的胶,倒很长的胶,延长电泳时间2.在不需要的片段上找一个酶切位点切开使之变短第一种方法如果都小于1kb应该很容易分开,如果大于2kb就很难分开；第二种方法一定行得通,但前提是要知道杂质DNA的序列
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1.75亿学生的选择
质粒多位点酶切片段回收?我做质粒酶切,除了引物带的酶切位点外,但是相隔40-50bp还有另外一个酶切位点,是不是可以做一个不完全酶切,得到我的目的片段,采用琼脂糖凝胶电泳是否可以分开,具体电泳的参数又是怎么设计的呢?
引物两端的酶切位点是否一样,还有,距离40-50bp的酶切位点是否也是同一个酶.如果是的话,环形质粒就会切成三段,有一个40-50bp,有一个目的条带,还有载体条带,是可以分开的.如果是不同的酶,你就可以选择使用不同的酶,根据你的要求进行切开.建议在设计引物时,选择目的基因中没有的酶切位点,选择载体上有的,并且根据在载体上的位置,确定是上游引物还是下游引物,在连接表达载体时就不会出现反连,操作就容易多了.
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扫描下载二维码50bp-400bp的目的片段，胶浓度多少合适凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊(胶浓度,凝胶电泳,跑胶) - PCR实验 - 生物秀
标题: 50bp-400bp的目的片段，胶浓度多少合适凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊(胶浓度,凝胶电泳,跑胶)
摘要: [50bp-400bp的目的片段，胶浓度多少合适凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊(胶浓度,凝胶电泳,跑胶)] 我的目的片段一个是100多bp，一个是300多bp，Mark选的是50bp单位的，今天早上跑胶的时候电压选110v，胶浓度1 5%，跑了30分钟，但是结果不好，连Mark都没有跑开，请问像这种大小的目的片段，一般来说胶浓度多少合适？凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊？谢谢 关键词:[胶浓度 凝胶电泳 跑胶]……
我的目的片段一个是100多bp，一个是300多bp，Mark选的是50bp单位的，今天早上跑胶的时候电压选110v，胶浓度1.5%，跑了30分钟，但是结果不好，连Mark都没有跑开，请问像这种大小的目的片段，一般来说胶浓度多少合适？凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊？谢谢
回复理论上你的胶浓度1.5%可以的，电压我通常100v就可以了，你的电压用了110v而且还是30min肯定跑没了，条带不长不必用110v，也不用那么长时间的回复1.5%的胶应该也可以，不过片段不大，建议用2%的胶，电压问题倒不大，不过要看好溴酚蓝的位置。回复跑胶基本是随意，我跑1.1kb的片断，用过1.0-3.0%的都没问题，只要别太离谱就行，电压也随意，也是只要别太离谱，还有就是不要跑过了。回复对了，胶的浓度高跑出来的图要比浓度低的好看。回复这样，用2%的胶，电压100v，时间30min。回复
琼脂糖凝胶电泳知识：琼脂糖凝胶浓度（%）线状DNA分子分离范围（kb）0.35--600.61--200.90.5--71.20.4--61.50.2--32.00.1--2及配制：50×TAE缓冲液:2 mol/L Tris-乙酸, 0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)。 配制1000 ml 50×TAE缓冲液方法：Tris 242 g， 冰乙酸 57.1 ml，0.5 mol/L EDTA 100 ml，加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.1×TAE缓冲液的配制:量取20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.5×TBE缓冲液（Tris-硼酸）: 配制1000 ml 5×TBE缓冲液方法：Tris 54 g，27.5g硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)。加去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶。配制100 ml溴化乙啶贮存液方法：称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.。6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油（或40%蔗糖）。配制10 ml 6×上样缓冲液方法：溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg，甘油 3 ml，用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.琼脂糖凝胶电泳操作步骤：1). 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2). 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3). 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4). 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用系统拍照保存.常见问题及注意事项：1.配糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊NA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA > 线状DNA > ocDNA. 添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的量,加样量的多少依据加样孔的大小及中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.
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电话：021-如何跑开两个长度相差很小的DNA片段(碱基,电泳切胶,分辨率,切胶) - PCR实验 - 生物秀
标题: 如何跑开两个长度相差很小的DNA片段(碱基,电泳切胶,分辨率,切胶)
摘要: [如何跑开两个长度相差很小的DNA片段(碱基,电泳切胶,分辨率,切胶)] 请问：如果电泳切胶纯化时 目的DNA片段和 非目的片段 长度只相差20几个碱基，如何提高分辨率，使两条带跑开的距离 大点 以便于切胶！！！谢谢！！！ 关键词:[分辨率 电泳切胶 碱基 切胶 条带]……
请问：如果电泳切胶纯化时 目的DNA片段和 非目的片段 长度只相差20几个碱基，如何提高分辨率，使两条带跑开的距离 大点 以便于切胶！！！谢谢！！！
回复听说提高胶的浓度可行，还有其他方法吗？回复我也遇到这样的问题,焦急等待中......回复片段多大啊？片段小的话，可以用PAGE胶。片段大，试试高浓度的糖回复25５bp　和　２２９bp. Thank you!!!回复一般可以通过以下两种途径来解决：1 用聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较适合分离小片段（5~500bp），且其分辨能力很强，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的都可以彼此分离，但其置备和操作更为繁琐一些。2 配制浓度更大的胶，如1.2~1.5%，你的两片段相差20多bp，跑时间稍微长点，电压不要太高，应该可以分得开，推荐试试这种方法。。回复想办法，加个内切酶将不要的杂带再切一刀！回复善己身 您好！电压不要太高，电压到底控制在多少范围呢？麻烦说详细一点，谢谢！回复有点不解：电场力公式为：F=qE， 电势能公式为E=Uq (q为所带电荷，U为电压）所以F=Uq2。而F=ma （a为加速度） 则：Uq2=ma
而s=1/2at2所以s=1/2*Uq2/m*t2
则两条带 距离=s1-s2=1/2*U*t2(q12/m1-q22/m2)可以看出：两条带的距离 和 电压U ，时间t 的平方 成正比。回复如果这样的话，应该加大电压才对啊？回复你没考虑阻力！两条带可看成匀速运动。速度不同，时间差越大，距离就拉的越开减少电压是使DNA受力适当，跑的快阻力就大，运动的不太稳，，慢慢跑的话条带较整齐，而且避免少数DNA因为不稳而不能成功分开制胶时加热维持一段时间，尽量使胶均匀电压用4V/cm，，如果不照相的话就尽量跑久点我做了个差距不大是DNA条带分离，100bp的Marker,都快跑出胶啦我发现会有拖尾现象，可能是我制胶不匀，或电压胶较高（5V/cm），所以推荐你4V个人意见，仅供参考回复谢谢你的意见！
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