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常用分离方法　
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分离纯化常用的色谱分离方法有哪些它们的原理是什么
10-01-02 &匿名提问
一种应用高速逆流色谱分离纯化和厚朴酚与厚朴酚的方法，它包括：分离溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，其体积比为1∶0.4∶1-1.2∶0.4-0.6，将上述溶剂体系置于分液漏斗中充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取一定量的厚朴提取物溶解于3-10ml上相和3-10ml下相的混合溶液中。首先将固定相用泵以9ml/min的流速灌满色谱分离柱，然后将柱的首端与六通进样阀相接。开启速度控制器，当转速达到800r/min时，开始以2ml/min的流速泵入流动相，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物。用高效液相色谱法测定各试管溶液中各成分，将不同成分分别收集、浓缩、干燥。分离得到的和厚朴酚与厚朴酚的纯度都在95％以上。      在现代生化制备技术中，色谱分离占有核心地位，可用于分离各种初级代谢产物如氨基酸、核苷酸、单糖类、有机酸、脂肪酸；次级代谢产物如生物碱、萜类、精油、糖苷、色素；各种生物大分子如蛋白质、多肽、酶、核酸、多糖。色谱方法根据分离机制的不同可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤（分子筛）色谱和亲和色谱等。　　第一节 吸附色谱法　　吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于该吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。该法是最早期的一种色谱分离技术，主要应用于某些分子量不大的物质的分离提纯，个别的如羟基磷灰石也适用于生物大分子的分离提纯，应用范围比较广。　　一．吸附过程的本质　　吸附是表面的一个重要性质之一。任何两相都可以形成表面，其中某相或溶解在某相中的溶质，在该表面的密集现象称为吸附。在固体与气体之间、固体与液体之间、液体与气体之间都可以发生吸附现象。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来，然后再吸附、再解吸，形成一个动态平衡。吸附色谱过程就是不断地产生吸附与解吸的矛盾统一的过程。凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂；聚集于吸附剂表面的物质就成为吸附物。　　二．硅胶　　应用最为广泛的一种极性吸附剂，主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量。硅胶的吸附活性取决于含水量，当含水量小于1%时活性最高，大于20%时吸附活性最低，一般采用含水量10-20%的硅胶。 　　用硅胶进行色谱分离时，要提前进行活化和纯化。纯化即降低硅胶活性，实验表明，硅胶加入4-20%水后，表面活性部位被纯化，样品溶质在吸附剂上的吸附和解吸过程加快，同时传质作用得到改善，最终柱效大幅提高。活化是指在150-195℃加热硅胶，活化覆盖有第一层小分子的硅胶，提高硅胶对样品溶质的吸附能力，其缺点是导致硅胶极性上升，产生催化反应或不可逆吸附。　　此外常用的还有：1）氧化铝 分为碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝，其吸附活性与含水量关系很大，在一定温度下除去水分可使氧化铝活化；2）活性炭 分为粉末活性炭、颗粒活性炭和锦纶活性炭，其吸附能力在水溶液中最强，使用前一般在150℃加热4-5小时，将吸附的大部分气体除去，锦纶活性炭则在100℃以下进行。3）聚酰胺 国外称尼龙，国内称锦纶，特别适合低分子量化合物的分离，如酚、羧酸、DNP-氨基酸、醌几芳香族化合物等。4）聚苯乙烯吸附剂 5）磷酸钙 在无机吸附剂中，磷酸钙是唯一适用于生物活性高分子物质分离的吸附剂，主要用于蛋白质的色谱分离、也适用于较小分子的核酸如转运RNA。　　三．吸附柱色谱的实验技术　　1． 吸附剂的选择及处理　　吸附剂分为无机吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙，有机吸附剂如纤维素、淀粉、蔗糖、聚酰胺等。一般来说，所选择吸附剂应有较大的比表面积和足够的吸附能力：对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力；与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应；吸附剂颗粒均匀。 吸附剂一般先经过筛获得均匀的颗粒（100-200目），对含有杂质的吸附剂可用有机溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等浸泡处理或提取除去，有些吸附剂可用沸水洗去酸碱使呈中性，有些需经加热处理活化。　　2. 溶剂与洗脱剂　　两者常为同一组分,但用途不同。习惯上把用于溶解样品的溶液称为溶剂，把用于洗脱洗脱柱的溶液称洗脱剂。原则上所选的溶剂和洗脱剂要求纯度高，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘度小，易流动，易与洗脱的组分分开。常用的溶剂和洗脱剂有饱和碳氢化合物、醇、酚、醚、卤化烷、有机酸等。　　3． 柱的装填和样品的加入　　色谱柱一般为玻璃或有机玻璃管制成，柱下端装上一块2-4号烧结玻璃或垫一层玻璃丝以支持吸附剂，管内装吸附剂。有条件可附加压或减压装置，使流速保持恒定，色谱柱外也可配恒温管套。　　装柱的方法通常是将一种在适当溶剂中的吸附剂调成糊状，慢慢地倒入关闭了出水口的柱中，同时不断搅拌上层糊状物，赶去气泡，并使装填物均匀的自然下降，装置所需要的高度后，打开出水口，让溶剂流出。注意柱的任何部分不能流干，即是说、再柱的表面始终保持着一层溶剂。　　小心地用移液管把样品液绕柱内壁小心地加入，不要冲击着吸附剂的表面。加样的另一个办法是用一个注射器和蠕动泵把样品直接送到柱表面上。　　3. 洗脱　　在整个洗脱过程中，要使洗脱液通过柱时保持恒定的流速，可以用调节&操作压&来调控（操作压相当于在柱上面的贮液瓶中溶剂的水平和柱出口位置的水平之差）。另一个方法是时用蠕动泵。　　洗脱过程中柱内不断发生溶解（解吸），吸附，在溶解，在吸附。被吸附的物质被溶剂解吸，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂又把该物质自溶剂中吸附出来，后来流下的新溶剂又在使该物质溶解而向下移动。如此反复解析，吸附，经过一段时间后，该物质向下移动至一定距离，此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力及溶剂对该物质的溶解能力有关，分子结构不同的物质溶解度和吸附能力不同，移动距离也不同,吸附较弱的就易溶解，移动距离较大。经过适当时间后，各物质就形成了各种区带,，每一区带可能是一种纯物质，如果被分离物质是有色的，就可以清楚地看到色层。随着洗脱剂向下移动，最后各组份按吸附力的不同顺序流出色谱柱，以流出体积对浓度作图，可得由一系列峰组成的曲线，每一峰可能相当于一个组分。　　第二节 离子交换色谱法　　离子交换作用是指一个溶液中的某一种离子与一个固体中的另一种具有相同电荷的离子互相调换位置，即溶液中的离子跑到固体上去，把固体上的离子替换下来。这里,溶液称流动相，而固体称固定相.　　一. 离子交换剂的类型　　1． 聚苯乙烯阳离子和阴离子交换树脂　　这是最重要一类离子交换树脂，由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，在引入所需要的酸性基或碱性基而成。根据引入的可离解基团的性质又可分为下列两类离子交换树脂： 1)聚苯乙烯阳离子交换树脂 这类交换剂可再分为强酸型、中强酸型及弱酸性三种；2）聚苯乙烯阴离子交换树脂 也可在分为强酸性、中强酸性及弱酸性三类。　　2． 聚丙烯酸阳离子交换树脂　　是由甲基丙烯酸和二乙烯的聚合而成。这类树脂具高度的交换量，每棵树脂可交换10毫克当量物质。这种高度缔合的非离子化羧基使树脂的表面形成一个亲水平，对极性分子能起一种很有效的吸附作用。　　3． 其它离子交换剂　　1）选择性离子交换剂 是利用某些特殊的有机溶剂可与某些金属离子起选择性反应的原理而制备的。如用含汞的树脂分离含巯基的化合物（辅酶A，半胱氨酸，谷胱甘肽）。　　2）吸附树脂 是一类有很大的表面积，吸附能力强，离子交换的能力很小的树脂。主要用于脱色和除去蛋白质等，也成为&脱色树脂&。　　3）电子交换树脂 这类所交换的不是离子而是电子，交换反应是个氧化还原反应，也称&氧化还原树脂&。　　由于上述几种离子交换剂与生化物质的分离制备关系不大，这里不作详细介绍。
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媒介选择ligand 已经被结合对矩阵是最简单的解答。选择被预先包装的专栏譬如HiTrap 或HiPrep 不仅将是方便, 但并且将节省时间方法优化作为这些专栏被提供以详细的指示为最宜表现。如果ligand 是可利用的, 但需要被结合对一个前被激活的矩阵, 参见章节5 。如果适当的ligand 不是可利用的, 决定是否它值得时间和努力被介入获得一ligand 和开发一个具体亲合力媒介。在许多情况下, 它也许是更多方便使用供选择的洗净技术譬如离子交换或疏水互作用色谱法。媒介和缓冲的准备存贮解答和防腐剂应该周到地以前冲走使用任何亲合力媒介。Re 胀大亲合力媒介被供应作为被冰冻干燥的粉末在正确缓冲依照由制造商推荐。使用高质量水和化学制品。解答应该被过滤通过0.45?m 或0.22?m 过滤器。亲合力媒介再用取决于样品的本质, 应该只执行以相同样品防止cross-contamination 。如果亲合力媒介将定期地被使用, 必须被保重保证那任何污染物从粗暴样品可能被不损坏的规程去除ligand 。束缚和elution 缓冲是具体的为各个亲合力媒介因为这是他们的影响在互作用在目标分子和促进的ligand 之间affinitybased分离。一些亲合力媒介也许并且要求具体缓冲为了做媒介准备好待用再。17避免使用磁性绞拌器如同他们也许损坏矩阵。使用温和的自转或结束在结束搅动。样品准备和应用样品应该是确切和释放从粒状物质。简单的步澄清样品在开始洗净将避免堵塞专栏, 也许减少需要为之前严密洗涤物规程, 可能延长色谱分析的媒介的生活。附录1 包含样品准备技术概要。如果可能, 测试ligand 的亲合力: 瞄准分子互作用。太低亲合力将导致粗劣的出产量因为目标蛋白质也许洗涤通过或泄漏从专栏在试样应用期间。太高亲合力导致低出产量从目标分子不可以离解从ligand 在elution 期间。束缚目标蛋白质也许由调整使更加高效率样品对约束缓冲的构成和酸碱度: 进行缓冲交换使用脱盐专栏或稀释在约束缓冲(参见页134) 。样品准备技术应该保证组分知道干涉与束缚(互作用在目标分子和ligand 之间) 被取消。因为亲合力色谱法是一个约束技术, 样品容量不影响分离只要情况被选择保证目标蛋白质束缚强烈对ligand 。它也许是必要测试对于在期间给最高效率的捆绑的流速试样应用因为这个参量可能变化根据具体互作用在目标蛋白质和ligand 和他们的集中之间。专栏必须是pre-equilibrated 在约束缓冲在起点试样应用之前。
媒体已经挑选了配有耦合矩阵是最简单的解决办法.选拔浆或蛋白质85%等栏目,不仅将更加便捷,而且节省时间,因为在这些栏目优化方法得到最佳表现详细指示.如果配有空,但须同时要预先激活矩阵,指第五章.如果没有合适的配面世看看是否值得付出时间和精力从事申请配,并形成具体中等亲和力.在许多情况下,可以更方便地使用替代或离子交换纯化技术,如疏水层析.缓冲储存媒体及制备方法和防腐剂使用前应彻底冲走有亲和力的媒介.再度膨胀亲和力媒体供应作为冻干粉缓冲的正确建议厂家.使用优质水和化学品.解应先由0.45微米或0.22微米的过滤器.回亲靠媒体的性质和抽样样本只应表现相同,以避免交叉污染.如果一个中等亲和力是用来学家必须小心确保任何污染物,可以从粗样品的程序不拆除损坏的配.约束力和洗脱缓冲特有的亲和力中型因为每个企业对目标分子的相互作用和配体,便于affinitybased分离.一些媒体可能还需要一个具体的亲和力,使中等缓冲准备再次使用.1917年避免使用磁力搅拌器,因为它们可能破坏基质.轻度轮换使用或最终超额完搅拌.样品制备及应用样本应该清楚且无颗粒物.简单的步骤开始之前澄清抽样避免堵塞纯化柱、可减少需要严格的洗涤程序,并能延长寿命的层析介质.附录1概述样品制备技术.如果可能,测试亲和力配:目标分子的相互作用.太低亲和力将使穷人产量自洗靶蛋白可能通过泄漏或从柱在抽样申请.过高将导致产量低亲和力的对象不一定游离分子配在洗脱.约束力的目标蛋白可以更有效地调整样品的组成及pH缓冲约束力:演出用的缓冲区交换脱盐柱或稀释缓冲约束力(见134页).样品制备技术应确保元件结合已知干预(目标分子的相互作用和配体)被清除.既然是有约束力的亲和层析法、样本数量并不影响分离的条件,只要选定目标,以确保强烈的约束力蛋白质配.可能有必要为测试流量,使最有效率的约束力,因为这期间申请样品的具体参数可按靶蛋白质相互作用及其与配浓度.栏必须预先在结合缓冲平衡之前开始抽样申请.希望可以幫妳
媒介选择一ligand已经连接到一个矩阵是最简单的解决。 选择预先包装列诸如HiTrap或者HiPrep将不仅仅更方便，但是也将在中节省时间方法优化当这些列被提供最佳的详尽的指令时性能。如果一ligand是可供使用的，但是需要被连接到一个前激活的矩阵，参阅第5章。如果没有适合的ligand不可供使用，决定它是否是值得的时间和努力包括到获得一ligand和开发一种具体的密切关系媒介。 在许多情况下，它可能是更多方便使用诸如离子交换或者hydrophobic的预备的净化技术相互作用色层分离法。准备媒介和缓冲器存储解决方案和防腐剂应该在使用任何之前彻底地加以洗刷密切关系媒介。 再膨胀密切关系媒介作为中的冻结弄干了粉提供正确作为由制造厂的缓冲器。使用高的质量水和化学品。 解决方案应该通过0.45μm被过滤或者0.22μm过滤器。对密切关系媒介的再利用依赖于抽样的性质并且仅仅应该被执行有防止横跨污染的相同的抽样。如果一种密切关系媒介通常被使用，关心必须被拿保证任何从粗糙的抽样的污染物能被不破坏的过程移去ligand。自从它是他们的影响，捆绑和洗提缓冲器对每一密切关系媒介是具体的在有利于affinitybased的目标分子和ligand之间的相互作用时分开。 一些密切关系媒介也可能要求一个具体的缓冲器为了做为对于使用作好准备的媒介再一次。17当他们可能破坏矩阵时，使用磁性的搅动者避免。 使用温和的旋转或者结束微型结束激动人心。抽样准备和应用抽样应该是清楚的和没有颗粒状的问题。 简单的步骤澄清一种抽样在开始净化之前将避免阻塞列，可能减少对的需要严格的洗涤过程并且能扩展chromatographic媒介的生活。附录1包含抽样准备技术的一种综述。如果可能的话，测试ligand的密切关系： 目标分子相互作用。 太低密切关系意志在贫穷的产量中的结果自从目标蛋白质可能通过洗涤或者从列渗漏在抽样应用期间。 太高密切关系将自从目标分子以来导致低的产量可能不在洗提期间从ligand分离。目标蛋白质的捆绑可能被调整抽样使更有效到捆绑的缓冲器的作品和pH： 使用除去执行一个缓冲器交换列或者在捆绑的缓冲器(参见第134页)中稀释。抽样准备技术应该保证为所知道的组成部分干扰捆绑(目标分子和ligand )之间的相互作用被移去。由于密切关系色层分离法是一种捆绑的技术，抽样卷不影响只要条件被选择保证目标蛋白质固定分开强烈ligand。它是可能必要为了在期间给最有效的捆绑的一种流率测试自从这参数以来抽样应用能根据具体的相互作用变化在目标蛋白质和ligand和他们集中之间。列必须在开端抽样应用之前在捆绑的缓冲器中被平衡。
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分离方法全套课程.ppt296页
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当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（f ’M）,用表示；当mi、mS用质量单位时,
以（f ’W）,表示。 3.
常用的几种定量方法
特点及要求： 归一化法简便、准确。 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大， 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。 归一化法： 外标法： 外标法也称为标准曲线法。
特点及要求：
外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。 1.反相色谱法特点
固定相是利用硅胶表面的游离羟基与各种有机硅烷反应，生成Si-O-Si-C键。
化学键牢固、耐各种溶剂、耐热、柱效高、样品容量大。 能灵活选择流动相，既可分离非离子型化合物，又可分离能离解的或离子型化合物。 色谱系统简单，分析快速，重现性好，柱平衡时间短，柱寿命较长。
反相色谱法的不足：
以硅胶为基质的柱填料能使用的pH值范围局限在2～7.5。 在硅胶表面往往留有一定量未反应的硅醇基，这些活性作用点会吸附溶质，使峰拖尾。 保留机制比其他色谱复杂，需要进一步探讨。
反相色谱的分离模型 当一个非极性溶质或溶质分子中非极性部分与极性溶剂接触时，相互产生斥力，自由能增加。溶质分子中非极性部分的取向导致极性溶剂中形成一个空腔，这种效应称为“疏水”或“疏溶剂效应”。 溶质保留主要不是由于溶质与键合配体之间非极性相互作用，而是由于溶质受极性溶剂的排斥力，促使溶质与键合相烃基发生疏溶剂化缔合。
2.保留机理 （1）疏溶剂理论 solvophobic theory
溶质与键合非极性配体的疏溶剂缔合示意图 箭头表示各种作用力 溶质 S 与键合相
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