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【求助】基因敲除小鼠鉴定--PCR及电泳结果分析
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这个帖子发布于2年零154天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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大家好。最近在做关于IRAK-M基因敲除小鼠的鉴定，但是未能成功，想请教一下诸位高手。按照常规：剪鼠尾2-5mm→裂解提取DNA→PCR→琼脂糖电泳。图如下：PS：1-7：PCR退火温度为58℃产物。8-14：PCR退火温度为67℃产物。1-3为基因敲除小鼠。4-5为野生型小鼠。6-7为内参GAPDH。目标基因片段：野生型：600bp。敲除型：500bp。杂合子：两者均有。①PCR：Jackson官网上面提供的引物序列，但是其中PCR条件中退火温度为67℃，觉得有点过高，就跑了梯度PCR（primer-blast上面输入引物序列之后，引物Tm值为60℃左右）：58℃，62℃，67℃均已尝试。②琼脂糖电泳：尝试过1.5%和2%的浓度。已经重复多次，把其中能想到的环节干扰均一一排除，但是还是没有任何目的条带。如果是反应体系的问题，但是内参有条带啊。实在是解释不通。盼各位高手解答，能让这个实验 柳暗花明又一村哈。谢谢。
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把退火温度再降下来一些吧。55甚至50.再尝试一下，因为你这个完全看不到条带。
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改改条件，条带都没有。理论上两条条带至少有一条
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内参能扩增，可以排除DNA的问题，那就是PCR体系的问题：重新溶解引物并且把PCR试剂全换新的试试。
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ghoti 内参能扩增，可以排除DNA的问题，那就是PCR体系的问题：重新溶解引物并且把PCR试剂全换新的试试。除了引物之外，PCR体系里面用的东西内参和小鼠的都是一样的呀。而且我的引物分别使用了生工和invitrogen的，都不行。
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在PCR体系内加上不高于10%体积的DMSO试试。
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最终延长了裂解时间，提高了裂解温度。多次重复试验之后得到了目的条带。谢谢各位的解答及帮助。
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tracy-sunshine 最终延长了裂解时间，提高了裂解温度。多次重复试验之后得到了目的条带。谢谢各位的解答及帮助。 亲···求助啊。。 。我也遇到了一样的问题。也是jackson的小鼠。引物和程序按照官网给的。WT.COMMON.mutant三种。 跑了无数遍了。。。具体怎么解决的啊。。。裂解时间和温度分别多少呢？
求助···
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骑羊的笨笨
亲···求助啊。。 。我也遇到了一样的问题。也是jackson的小鼠。引物和程序按照官网给的。WT.COMMON.mutant三种。 跑了无数遍了。。。具体怎么解决的啊。。。裂解时间和温度分别多少呢？
求助··· 网站上写的是Tm值70度，我用梯度PCR验证的，最终确定Tm值是60度，差的还挺远的。你可以尝试一下
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骑羊的笨笨 tracy-sunshine ?最终延长了裂解时间，提高了裂解温度。?多次重复试验之后得到了目的条带。?谢谢各位...亲···求助啊。。 。我也遇到了一样的问题。也是jackson的小鼠。引物和程序按照官网给的。WT.COMMON.mutant三种。 跑了无数遍了。。。具体怎么解决的啊。。。裂解时间和温度分别多少呢？ 求助···谢谢，已解决
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请问你延长裂解时间，提高裂解温度是在鼠尾提取DNA那一步吗？具体延长到多久，温度提高多少可以告知吗？
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关于丁香园→ 请问怎么构建一个RIG-I基因敲除小鼠?其原理和技
请问怎么构建一个RIG-I基因敲除小鼠?其原理和技
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怎么构建一个RIG-I基因敲除小鼠?其原理和技术流程?
ironman_nhdx
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&&&&&&这个是不是太专业了，你应该去医生交流区问http：///
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基因敲除常见方法
一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）
常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）
条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠（Knockin）
基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：
基因敲除其他方法：
一、ZFN技术制作基因敲除鼠
ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
二、TALEN技术制作基因敲除鼠
TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。
相关大小鼠实验||||||||||||
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华裔研究组获得基因敲除技术重大突破
来自美国南加州大学干细胞中心，Keck医学院等处的研究人员首次成功的获得了基因敲除大鼠，这是到目前为止，世界上第二种完成基因敲除的动物模型，该研究为进一步分析人类疾病提供了一种新的平台。这一研究成果公布在生命科学研究顶级刊物《Nature》杂志在线版上。领导这一研究的是美国南加州大学干细胞中心应其龙博士，其早年毕业于第一军医大学，1999年应其龙博士远渡重洋至英国爱丁堡大学干细胞研究所，开始了干细胞研究工作，在2008年年底，应其龙副教授领导的科研小组历史上首次从大鼠中获得了真正的胚胎干细胞，这一突破将有利于研究人员创建更有效的动物模型，用于人类疾病的研究。为了更深入了解这一研究成果，生物通联系了国内专家钱其军教授，对这一研究的思路，以及技术发展等进行了分析，就读者感兴趣的一些问题进行了请教。&&小鼠基因敲除技术是研究许多新基因的重要工具，因此这项研究成果也获得了诺贝尔奖，但是这一技术至今还未在第二种动物中实现过，而作为与小鼠同样应用广泛的模式动物：大鼠，迄今为止，科学家们还不能从遗传操作的角度在这种动物中敲除，或者添加某种基因。但是由于大鼠在很多方面更接近于人类，因此如果能实现这种模式动物的基因敲除，将有利于未来创建更有效的动物模型，用于人类疾病的研究。正如钱其军教授说的那样，&由于大鼠在很多方面更接近于人类, 因此大鼠的基因敲除模型将会广泛应用于各种研究。&要想获得大鼠基因敲除模型，势必会遇到许多技术难题，其中的关键就在于建立能生殖传代的大鼠的胚胎干细胞株，同时也需寻找最佳受体的囊胚。研究人员首先需要对动物进行遗传工程操作，这要求科学家能将干细胞（比如生殖细胞）培养成完整的动物个体，而应其龙研究组在之前的研究中就积累了这方面的许多经验，其研究组一直以来都从事胚胎干细胞研究，曾发表多篇《Nature》，《Cell》文章，比如曾在Nature文章中证实干细胞移植主要原因可能是细胞融合而不是分化，这是干细胞开创性进展之一。在最新的这项研究中，研究人员在大鼠中成功的敲除了一种著名的抑癌基因：p53，这个基因可以说是癌症研究中的明星基因，对它的研究已经从一种抑癌基因，发展到几十种抑癌基因群体，从一条单一细胞通路，发展成多种细胞信号网络。因此p53敲除大鼠模型的建立对于未来分析癌症机理，信号网络具有重要的意义。那么为什么研究人员会选择了p53作为敲除基因？钱教授在回答这一问题的时候说，&P53基因是目前研究最多的基因之一，如P53基因突变与肿瘤发生有关，小鼠的P53基因敲除可发生肉瘤，而并非发生类似于人类癌症，而且P53基因小鼠肉瘤的发生率也较低。在大鼠中进行P53基因敲除是否会发生类似于人类癌症组织值得关注。&另外还有一个研究人员十分关注的问题：在敲除基因操作方面，小鼠和大鼠有何区别？生物通也就这一问题请教了钱教授，钱教授表示这两者并无明显的区别，那么也就是说在未来的应用方面，大鼠基因敲除技术很可能会像小鼠基因敲除技术一样，成为一种新型分子生物学技术，被广泛应用到生物学领域中的各个方面！来源：生物通&
(来源：生物通)
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【求助】标书里面基因敲除鼠的来源处理问题。
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问题已解决悬赏丁当:2
标书中需要用到基因敲除鼠，但是目前还木有找到卖这个鼠的公司。标书里面怎么写啊？理论上别人赠送，要提交转让合同。或者写明来源。但是现实没有找到买这个鼠的公司啊。难道写基金申请下来了，再去敲除老鼠吗？感觉这么写可能就被毙了。咋木板？万能的网友们？还是不用基因敲除鼠了？？？？？
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lkswordstar008 个人建议不要写，敲除一是时间长，二是经费高，标书一般是你已经成功了才考虑赞助，所以建议你写其他方法如果还没成功的话，是青年吗1.基因敲除小鼠来源主要有三种：a.国内外基因敲除小鼠保种机构购买，比如Jackson，MMRRC，上海南方模式生物，南京模式所；b.国内外科学家自主研发基因敲除小鼠赠送（需要赠送方允许，签署MTA）；c.国内外基因敲除小鼠研发机构研发，国外主要是各大学、研究所，国内比如上海南方模式生物研究中心。2.对于a、b情况，写标书时向保种机构或赠送人要基因敲除小鼠资料即可；对于c情况，写标书时如果还没有现成的基因敲除小鼠会比较被动，但可以向研发机构咨询，提供基因及实验目的信息，一般如上海南方模式生物研究中心会免费提供基因敲除小鼠研发的《可行性研发报告》。当然以上前提是对如何运用对应基因敲除小鼠做实验研究自己一定要比较清楚，如此科学研究的周期、成本上自己也能做到胸有成竹。3.至于是基金申请下来前还是下来后再考虑基因敲除小鼠，越来越多的科学家选择下来前。不打无准备之仗嘛！基因敲除小鼠到位了，在和申基金的很多科学家每年交流的时候，他们坦言虽此非规定，但有了的话，申请人，申基金的人心里都能更踏实嘛。PS：更多欢迎关注我或联系我咨询，希望此贴可以帮住到更多的战友。承让！
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yeyang1222 关键是写的时候就是基因过表达和基因干扰方法按顺序写－－－如前面结果成立，进一步转基因及基因敲除鼠模型建立，一切顺利成章，结果仔细一想，根本钱不够。写还是不写，求高手。???，求指点！1.基因敲除小鼠来源主要有三种：a.国内外基因敲除小鼠保种机构购买，比如Jackson，MMRRC，上海南方模式生物，南京模式所；b.国内外科学家自主研发基因敲除小鼠赠送（需要赠送方允许，签署MTA）；c.国内外基因敲除小鼠研发机构研发，国外主要是各大学、研究所，国内比如上海南方模式生物研究中心。2.对于a、b情况，写标书时向保种机构或赠送人要基因敲除小鼠资料即可；对于c情况，写标书时如果还没有现成的基因敲除小鼠会比较被动，但可以向研发机构咨询，提供基因及实验目的信息，一般如上海南方模式生物研究中心会免费提供基因敲除小鼠研发的《可行性研发报告》。当然以上前提是对如何运用对应基因敲除小鼠做实验研究自己一定要比较清楚，如此科学研究的周期、成本上自己也能做到胸有成竹。3.至于是基金申请下来前还是下来后再考虑基因敲除小鼠，越来越多的科学家选择下来前。不打无准备之仗嘛！基因敲除小鼠到位了，在和申基金的很多科学家每年交流的时候，他们坦言虽此非规定，但有了的话，申请人，申基金的人心里都能更踏实嘛。PS：更多欢迎关注我或联系我咨询，希望此贴可以帮住到更多的战友。承让！
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已经构建不行吗
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不可以自己构建吗
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为什么写了基因敲除就被毙，求高手回答
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最老实的做法是联系一家做小鼠基因敲除的公司，告诉他们你要如何敲，是全敲还是条敲，然后设计好，将设计图及证明作为附件放在标书中。
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会不会因为经费不够把你毙掉
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关键是写的时候就是基因过表达和基因干扰方法按顺序写－－－如前面结果成立，进一步转基因及基因敲除鼠模型建立，一切顺利成章，结果仔细一想，根本钱不够。写还是不写，求高手。???，求指点！
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写呀！如果按照标书说的，谁都会发Nature，事实上，可能吗？写标书时候不要想怎么完成！
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个人建议不要写，敲除一是时间长，二是经费高，标书一般是你已经成功了才考虑赞助，所以建议你写其他方法如果还没成功的话，是青年吗
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是面上项目
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lkswordstar008 个人建议不要写，敲除一是时间长，二是经费高，标书一般是你已经成功了才考虑赞助，所以建议你写其他方法如果还没成功的话，是青年吗1.基因敲除小鼠来源主要有三种：a.国内外基因敲除小鼠保种机构购买，比如Jackson，MMRRC，上海南方模式生物，南京模式所；b.国内外科学家自主研发基因敲除小鼠赠送（需要赠送方允许，签署MTA）；c.国内外基因敲除小鼠研发机构研发，国外主要是各大学、研究所，国内比如上海南方模式生物研究中心。2.对于a、b情况，写标书时向保种机构或赠送人要基因敲除小鼠资料即可；对于c情况，写标书时如果还没有现成的基因敲除小鼠会比较被动，但可以向研发机构咨询，提供基因及实验目的信息，一般如上海南方模式生物研究中心会免费提供基因敲除小鼠研发的《可行性研发报告》。当然以上前提是对如何运用对应基因敲除小鼠做实验研究自己一定要比较清楚，如此科学研究的周期、成本上自己也能做到胸有成竹。3.至于是基金申请下来前还是下来后再考虑基因敲除小鼠，越来越多的科学家选择下来前。不打无准备之仗嘛！基因敲除小鼠到位了，在和申基金的很多科学家每年交流的时候，他们坦言虽此非规定，但有了的话，申请人，申基金的人心里都能更踏实嘛。PS：更多欢迎关注我或联系我咨询，希望此贴可以帮住到更多的战友。承让！
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yeyang1222 关键是写的时候就是基因过表达和基因干扰方法按顺序写－－－如前面结果成立，进一步转基因及基因敲除鼠模型建立，一切顺利成章，结果仔细一想，根本钱不够。写还是不写，求高手。???，求指点！1.基因敲除小鼠来源主要有三种：a.国内外基因敲除小鼠保种机构购买，比如Jackson，MMRRC，上海南方模式生物，南京模式所；b.国内外科学家自主研发基因敲除小鼠赠送（需要赠送方允许，签署MTA）；c.国内外基因敲除小鼠研发机构研发，国外主要是各大学、研究所，国内比如上海南方模式生物研究中心。2.对于a、b情况，写标书时向保种机构或赠送人要基因敲除小鼠资料即可；对于c情况，写标书时如果还没有现成的基因敲除小鼠会比较被动，但可以向研发机构咨询，提供基因及实验目的信息，一般如上海南方模式生物研究中心会免费提供基因敲除小鼠研发的《可行性研发报告》。当然以上前提是对如何运用对应基因敲除小鼠做实验研究自己一定要比较清楚，如此科学研究的周期、成本上自己也能做到胸有成竹。3.至于是基金申请下来前还是下来后再考虑基因敲除小鼠，越来越多的科学家选择下来前。不打无准备之仗嘛！基因敲除小鼠到位了，在和申基金的很多科学家每年交流的时候，他们坦言虽此非规定，但有了的话，申请人，申基金的人心里都能更踏实嘛。PS：更多欢迎关注我或联系我咨询，希望此贴可以帮住到更多的战友。承让！
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周效华 1.基因敲除小鼠来源主要有三种：a.国内外基因敲除小鼠保种机构购买，比如Jackson，MMRRC，上海南方模式生物，南京模式所；b.国内外科学家自主研发基因敲除小鼠赠送（需要赠送方允许，签署MTA）；c.国内外基因敲除小鼠研发机构研发，国外主要是各大学、研究所，国内比如上海南方模式生物研究中心。2.对于a、b情况，写标书时向保种机构或赠送人要基因敲除小鼠资料即可；对于c情况，写标书时如果还没有现成的基因敲除小鼠会比较被动，但可以向研发机构咨询，提供基因及实验目的信息，一般如上海南方模式生物研究中心会免费提供基因敲除小鼠研发的《可行性研发报告》。当然以上前提是对如何运用对应基因敲除小鼠做实验研究自己一定要比较清楚，如此科学研究的周期、成本上自己也能做到胸有成竹。3.至于是基金申请下来前还是下来后再考虑基因敲除小鼠，越来越多的科学家选择下来前。不打无准备之仗嘛！基因敲除小鼠到位了，在和申基金的很多科学家每年交流的时候，他们坦言虽此非规定，但有了的话，申请人，申基金的人心里都能更踏实嘛。PS：更多欢迎关注我或联系我咨询，希望此贴可以帮住到更多的战友。承让！ 请问 我的标书里也用到基因敲除鼠，但事实上没有签过合同也没有说啥时购买，好在这个基因敲除鼠是成熟的，不用以后现敲，那这样的我能写在标书吗？标书里还要提供什么资料吗？
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fzdndx @周效华：1.基因敲除小鼠来源主要有三种：a.国内外基因敲除小鼠保种机构购买，比如Jackson，MMRRC，上海南方模...请问 我的标书里也用到基因敲除鼠，但事实上没有签过合同也没有说啥时购买，好在这个基因敲除鼠是成熟的，不用以后现敲，那这样的我能写在标书吗？标书里还要提供什么资料吗？1.没有签过合同也没有说啥时购买没有关系，关键在于届时你能获得相应小鼠做实验，考虑到动物繁育、实验的周期，做好提前做好前后各个方面的运输、实验设计。2.好在这个基因敲除鼠是成熟的，不用以后现敲。不知您说的“成熟的，不用以后现敲”的具体意思。国际上有别人做过与自己手里现有还是有一定距离的。3.我以前中科院的导师的习惯是读到别人文章中用到自己将来可能需要的小鼠第一时间查原始文献自己或让学生发去email要看看，不管国内国外。4.别人用相应基因敲除等小鼠获得了自己感兴趣的实验数据及自己已经现有或正在引种、研发、基本研发成功的小鼠可以这样写在标书里。5.标书里还要提供什么资料吗？有些时候需要自己单位或引种研发单位的具体小鼠基本基因修饰信息，《实验动物生产许可证》、《实验动物使用许可证》。如果需要，可关注留下邮箱联系我咨询。
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基因敲除小鼠的来源处，你可以写“委托某某公司进行制备”，同时可以委托这家有制备基因敲除小鼠实力的公司出一份证明材料即可，我们已经帮很多申请基金的老师出过这样的材料了，有了这样的证明能够大大提高基金申请的成功机率。如有需要可以联系我，.cn
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yeyang1222 关键是写的时候就是基因过表达和基因干扰方法按顺序写－－－如前面结果成立，进一步转基因及基因敲除鼠模型建立，一切顺利成章，结果仔细一想，根本钱不够。写还是不写，求高手。???，求指点！面上项目当然可以写呀，面上项目可以到80万，应该足够的，设计合理就行。只要必须做的，就可以。
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