[交流探讨] 01-01人什么时候才能跟癌细胞一样永生_宇宙吧_百度贴吧
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&签到排名：今日本吧第个签到，本吧因你更精彩，明天继续来努力！
本吧签到人数：0可签7级以上的吧50个
本月漏签0次！成为超级会员，赠送8张补签卡连续签到：天&&累计签到：天超级会员单次开通12个月以上，赠送连续签到卡3张
关注：504,627贴子：
[交流探讨] 01-01人什么时候才能跟癌细胞一样永生
如果人跟一样 细胞不会死亡那人是不是无限生长 然后吞噬行星 吞噬
3D双端东方魔幻网游「大青云」勾魂公测,穿越逆转,封神故事,全新演绎!
谁说癌细胞不会死
如果基因改造工程成熟，那么可以延缓细胞代谢时间
天地之间，无人永生！
你的错误在于认为可以永生，其实并不是的！人体是多细胞共生的一个复杂系统，任何一个种类的细胞单独存在都是无法生存的。也是需要氧气养分供给才能生存的，但由于癌细胞拼命繁殖自己而不顾其它细胞死活，挤占其它细胞空间，造成其它细胞缺少生存空间而死亡，这些死亡的组织细胞恰恰是供给癌细胞必须的养分的细胞，所以癌细胞的永生才是杀死自己的原因。
每对新人结婚成功的那一刻，送礼最多的吧友可以获得本次求婚的“月老”称号和成就,
所以对于多细胞的生物来说，永生就是癌症，就是通往死亡的捷径。
每对新人结婚成功的那一刻，送礼最多的吧友可以获得本次求婚的“月老”称号和成就,
可以变成机器人，哪个零件坏了换个就行
死了好，大多数人活着没意思的。
是细胞的，几十亿年前的就是一种单细胞生物，和现在的癌细胞特像，它们是在周围环境养分充足的情况下无限繁殖，那时侯它是一个独立的个体生命。后来细胞群体进化，构成一个系统来繁衍，细胞就变成了会衰老灭亡的一个零件，繁衍的任务交给了整个系统。而癌细胞的产生可以说是细胞基因突变为最原始的生命方式，或许是巧合，或许是进化，或许是上帝的杰作。当一个人死亡后，把他的癌细胞放进培养皿，癌细胞有几率会继续带着这个人的全部基因繁殖下去。电影《超体》中有一句话：当生命无法繁衍，细胞会选择永生。
HaLa细胞中文名海拉细胞，是上世纪50年代一个女性的，这个细胞可以无限分裂繁殖，而且繁殖速度比其他癌细胞都快，因此被医学界广泛用于细胞研究。至今已经出现了5个基于海拉细胞研究的诺贝尔奖。据推算，迄今为止培养出的海拉细胞已经超过了5000万吨，其体积相当于100多幢纽约帝国大厦。
宇宙瘦身法35天狂甩一身赘肉,宇宙瘦身法分享我的真实减肥故事
死亡是一座永远亮着的，无论你驶向何方，最终都将向它转向，一切终将逝去，只有死神永生
是一种非常低等的生命方式，你希望人类退化为单细胞生物？
做梦的时候
能量守恒定律 也是生物 没能量怎么存活
想起那年乘坐曲率飞船逃避维度打击时，听到你说起这件事，转眼已经是时间之外的往事。
没有什么生物是永生的，除了灯笼
你说到点子上了，说明是错的，每个人每个群体每个国家每个星球像癌细胞一样过度自私就会毁灭。反过来想，癌细胞是不是因为人太自私才会泛滥？
是可以无限分裂，不会像正常细胞分裂到一定次数就不能分裂而已。而且即使人类掌控癌细胞这种能力，并且运用也不能实现永生。人类大脑中的细胞，绝大部分都是不能再生分裂的，如果大脑中的细胞死的差不多了，那你也就离死不远了。
贴吧热议榜
使用签名档&&
保存至快速回贴卵子存活时间
【导读】又到了孕育小宝宝的时间了，准爸准妈们也是积极造人。卵子和精子结合的过程比较有趣，精子排出后会马不停蹄的找到卵子所在地，不过精子成千上万，而卵子只有一个，所以只有速度最快的精子才能和卵子卿卿我我。但你们会好奇卵子能存活多久吗？有没有可能在精子到底之前卵子已经不想玩了，这样就不能愉快生宝宝了。那么卵子存活时间是多长呢？
由爱而性本是很平常的一件事，但如果你们还不想要宝宝的话，还是要慎重一点，做好避孕措施。近几年暑假期间总会有很多学生们到医院做人流，于女性而言是对自己很不负责的一件事，要知道卵子和精子结合可能就是2天，3天的事情。这样的新闻被想要宝宝又不能生宝宝的夫妻身上，不知道是何滋味呢？闲话不说，今天我们要聊的是卵子存活时间。卵子和精子不同，卵子本身就存活在体内了。而且卵子的数量也是极多的，子宫里面的卵子可能有45万个呢。正常女性每月排一次卵，排卵日是大约在下一次月经来潮前的12-16天，如果在排卵期同房的话，很大机会会怀上宝宝呢。卵子存活时间一般为2天，也有存活3天的。而精子排出后能存活3天，不出意外的话，游得最快的那个精子是会跟卵子结合的，形成受精卵之后，就会着床，小宝宝的生命从精卵结合的那一刻起就开始了。
我们细细聊一下卵子在体内的存活时间，上面也提到卵子一直存在于女性体内。女宝宝出生的时候，子宫里面会有45万个卵子，有没有感觉有些震撼呢，不过这些卵子并不会一直都在，有一天也会衰老死亡，当身体不能排卵之后，卵子基本上就结束它的旅程了。当女性进入一个一会雷厉风行，一会梨花带雨的时期，卵子就要离开我们了。女筒子在45-55岁之间，身体基本不会再排出卵子，此时女性体内的卵子基本也就是没有了。所有卵子在体内存活时间就是女性步入更年期时候。其实在女性分娩的时候，大部分卵子会死掉，年纪越大身子骨慢慢变弱的时候，身体机能是慢慢弱化的，这个时候不论卵子，还是身体其他功能都会衰退，不过这是个自然过程，也无需忧心。
正常来说，每次来DYM之前女筒子是会排卵一次的，一般每月一次，但DYM就是不喜欢按常理出牌，月经不调的筒子们也是无奈。排卵之后的12-16天后，DYM就会来了。要是你们想要争取早点生小宝宝，那么得赶上排卵的时间呢。一般卵子排出以后，能存活的时间在2-3天，也有比较短的，可能卵子只能撑1天，所以要是精子在卵子永远沉睡之后来到的话，只能是竹篮打水一场空了。一般来说卵子在排出以后的6个小时以内受精能力是最强的，而且能维持受精能力30个小时，之后卵子就会变形了。想要生小宝宝的话，男筒子的精子活力要强大，要在卵子拥有最强大吸精能力的时候和它结合，生出来的小宝宝更加优良呢。其实每个孩子都是最强大的，因为只有游得最快的那个精子才可以和卵子结合。
一般来说，卵子排出之后，能存活2天左右，不过人体体质不同，有些卵子可以存活3天，不过也有些卵子只能存活1天。那么还有卵子有更短的存活时间嘛？也有卵子存活时间不超过12个小时的，还是蛮令人心塞的。卵子存活时间越短意味着什么呢？每个月只有一次排卵的机会，如果没有精子没有赶上的话，意味着要等到下一次排卵女性才有孕育宝宝的机会，等待是令人糟心和无奈的。如果夫妻们备孕好长一段时间都没有动静，可能是精子有问题，也可能是卵子存活时间太短了。不过精子进入子宫腔内能存活2-3天，虽然生育能力只能保存1-2天，所以如果卵子存活时间短，则需要在排卵之前AA，让精子在卵子附近stand&by才能取得和卵子结合的机会呢，所以即使卵子存活时间很短也不代表没有机会。话说回来，卵子存活时间不足12个小时的，会对小北鼻产生影响吗？其实是没有问题的呢，受精卵着床之后女筒子要精心养胎哦。
最后，我们来聊聊精子和卵子结合的话需要多长时间吧。其实每次同房的时候，男筒子是会排除上亿的精子，成千上万之上呢。这些精子首先跟着精液从阴道排出，慢慢的游到子宫颈管、子宫腔、然后才到达终点站，也就是卵子所在地。精子从踏上追求卵子的那一刻起，到和卵子结合，总共需要花费1-1.5个小时，最快的话只需要几分钟。不过要是精子游得很慢的话，可能要4-6个小时呢，那就错过了最佳的受孕时机了。其实子宫和输卵管也有帮助精子加快游走的速度呢，AA之后子宫会收缩输卵管会蠕动，如此一来就会加快精子的运行，所以有些精子短短几分钟就能和卵子结合啦。在正确的时间和卵子结合，小宝宝应该会聪明伶俐的，不过气质和涵养也是可以通过后天学习得到的呢，家长们要好好培养和教育小宝宝们哦。
选择食物分类
五谷杂粮补品干果豆/乳/奶制品零食/小吃饮品/饮料调味品水产品/海鲜水果肉禽蛋/野味蔬菜/食用菌食物加工篇草药
选择适用人群
客户端下载查看: 3746|回复: 4
积分241&威望241 &包包1152 &
积分241&威望241 &包包1152 &
, q! f0 ~8 l8 [&&P# j
因为我们处理细胞的实验室距离医院比较远，请问有什么其他好的运送方法?谢谢' w+ p- s& u&&U5 O; j) s
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 1&
积分305&威望305 &包包786 &
积分305&威望305 &包包786 &
用盐水在四度里保存应该可以吧，你要走多远的路？
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 2&
包包 + 10&
积分329&威望329 &包包787 &
积分329&威望329 &包包787 &
四度最好在4小时内，尽量不要超过8小时。时间太长的话，最好回输之前做个台盼蓝染色，看看细胞活率
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 5&
包包 + 10&
积分102&威望102 &包包605 &
积分102&威望102 &包包605 &
加些白蛋白，可以提高活率。
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 2&
包包 + 10&
积分305&威望305 &包包786 &
积分305&威望305 &包包786 &
曾经看过一篇文章，介绍四度状态下全血和单细胞保存状况。统计造血集落、流式、活性、细胞数的变化。全血在7天后基本数值为零，单细胞是4天后，基本上全血4度如果24小时的话，单细胞最多也就12小时。
欢迎参与讨论
总评分:&威望 + 5&
包包 + 15&
Powered by用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项_仪器仪表_中国百科网
用BRET方法研究活细胞中GPCR蛋白相互作用的基本注意事项
    K. M. Kroeger1, K. A. Eidne1, Bernd Hutter2
BRET已经成功的应用于研究哺乳动物细胞中GPCR同源和异源二聚体以及涉及到受体脱敏作用和交易的受体/β-arrestin相互作用（综述，1）。BRET的显著优势是可以在活细胞中，正确的的位置实时的监测蛋白质和蛋白质之间的相互作用。由于GPCR高度的疏水性和细胞本地化，测量蛋白质之间相互作用的常规技术（如：免疫共沉淀和酵母2杂交筛选）具有重大的缺陷。BRET是一个简单的，快速均一法，可以克服这些限制。对7TM受体是一个普遍的过程。这个方法可以作为研究非依赖于他们信号通路的几乎所有7TM受体的筛选方法。
BRET是一种自然发生的现象，举个例子：在水母和海蜇中发生的水母素和GFP之间发生的非放射性能量转移。可以通过标记了生物发光供体如：海肾的荧光素酶（Rluc）或者荧光受体如：增强型绿色或者黄色荧光蛋白（EGFP或EYFP）的融合蛋白来研究BRET的相互作用。
当相互作用的部分在细胞内共表达，在底物腔肠素存在的情况下，当蛋白质距离足够近（在100&A内），将发生能量从Rluc到EYFP的能量转移，发出发射光（2）。依靠于供体和受体分子的严格的距离使BRET成为研究涉及到所有GPCR功能和通过激动剂和拮抗剂的调节的受体蛋白相互作用的理想工具。相似的，涉及到荧光供体和受体分子之间的能量转移的FRET技术，也代表了一种检测GPCR蛋白相互作用，并且已经和成像技术结合在空间和时间上检测GPCR的相互作用的工具。不像FRET,它衍生出来的BRET不需要激发光，从而避免了自发荧光，漂白和细胞的损坏的相关问题。因此，低背景荧光的BRET技术在检测低水平或者较弱的蛋白质相互作用时候非常灵敏（3）。FRET代表了一种检测GPCR蛋白相互作用的，并且已经和成像技术结合在空间和时间上检测GPCR的相互作用的工具。通过单细胞BRET成像来确定蛋白质之间相互作用的细胞定位来显示在研究蛋白质相互作用的中的重大进步。
为了应用BRET技术来研究受体的相互作用，细胞中融合蛋白的共表达，如果这两个融合分子之间的距离足够近，那么光将从Rluc转移到EYFP.这个激发光，引起发射一个波长为530nm的发射光。BRET被定量为在相同情况下，530nm和480nm的发光比率。最初BRET是在大肠杆菌中研究光敏生物钟蛋白的相互作用（2），其他几个组现在使用BRET技术来研究哺乳动物细胞中GPCR蛋白的相互作用，包括受体同源二倍体（4-9）和异源二倍体（10-13）。GPCR和细胞内蛋白的相互作用要求也要使用BRET技术检测受体功能，如：涉及到受体脱敏作用和内在化的受体/β-arrestin的相互作用。因此，理论上，BRET也是研究针对GPCR功能的配体结合受体信号到脱敏作用，交易的受体相互作用的复杂实验的一种强大的工具。
Mithras LB940
Mithras LB940是一款多功能酶标仪。独立光路系统（DOPS-Dedicated Optical Path System）保证了检测技术要求的最优化表现。他们的功能有发光，BRET，荧光（顶读和底读），光吸收，荧光偏振和AlphaScreen™.另外，提供选配件如：试剂进样器，温度控制和冷PMT检测模块。
图2：独立光路系统和Mithras LB940
使用BRET方法研究一个潜在的蛋白质和蛋白质之间的相互作用涉及到几个步骤（1）产生两种感兴趣基因的蛋白质，他们的一个N和C末端分别和Rluc和EYFP融合。（2）在哺乳动物中共表达两种BRET融合蛋白。（3）检测BRET信号。这种方法可以应用于研究哺乳动物细胞中任何蛋白质和蛋白质之间的相互作用。并且对于涉及到GPCRs的相互作用研究页没有限制。
BRET融合结构的生产
构成编码BRET融合蛋白包括以下内容：
1.&表达Rluc-EYFP融合蛋白的BRET融合结构的阳性对照（见注2）。
2.&BRET结构的阴性对照：如：单独表达Rluc和EYFP的pRluc, pEYFP，GPCRs对照（非感兴趣的GPCR）和其他融合了Rluc或者EYFP的蛋白，（见注3）。在我们的研究中，我们利用促性腺激素释放激素（GnRH）促甲状腺激素释放激素（TRH）和β2肾上腺素受体，他们都是C末端和Rluc和EYFP结合（见注3）。
3.&首个感兴趣的蛋白的BRET供体结构，（C末端（GPCR/Rluc）或者N末端（Rluc/GPCR）标记为Rluc的GPCR的表达）（见注4-6）。
4.&第二个感兴趣的蛋白的BRET受体结构（C末端（GPCR/EYFP）或者N末端（EYFP/GPCR）标记为EYFP的GPCR的表达）（见注4-6）。
BRET融合结构的转染和共表达
1.&根据操作说明使用转染试剂来转染哺乳动物细胞（如：COS-1细胞，在转染以前，放置一天使6孔板的每个孔的密度达到2*105个细胞）（见注7）。
2.&单独转染带有GPCR/Rluc融合cDNA细胞或者共转染带有GPCR/Rluc和GPCR/EYFP融合的cDNA（见注8）。Rluc 和 Rluc-EYFP BRET对照 cDNA也一同被转染，作为实验的阳性对照。阴性对照转染也同时进行，包括：其他GPCRs融合到EYFP或者Rluc上显示非特异性的BRET信号。（见注3 & 8）。
1.&转然后48小时，使用磷酸盐缓冲液（PBS）/0.05%胰蛋白酶分离细胞。用PBS洗涤两次，悬浮在500&l的PBS。使用EYFP表达的流式细胞仪或者LB940多功能酶标仪的荧光模块分析每次转染的大约100000个细胞。（见注6）..对于BRET，96孔板的每个孔中添加40&l细胞悬浮液（大约20000个细胞）
2.&注入10ul腔肠素（新稀释到25&M）到每个孔中，获得最终浓度为5uM,并立即使用带有预设为所需温度（37度）加热模块LB940进行读数（见注9，10）。
3.&测试在相互作用中的激动剂和拮抗剂（或者其他试剂，化学/处理）的影响，增强BRET信号，试剂可以在添加腔肠素前预孵育。或者添加腔肠素，控制“未处理”读数数据，最后通过注射器添加最多三个试剂，随着时间的推移评估BRET比率的影响。
4.&采用综合读数10秒，收集通过两个不同波长范围的的滤光片的光。
图1：测量BRET信号的读数选项。第一个标记的发光为Rluc滤光片选项，第二个标记的发光为EYFP选项。
用两次测量的结果根据下面的公式计算BRET比率。
BRET比率=530nm发射光/480nm发射光
5.&然后，数据作为一个标准化的BRET比率。定义为，在同一个实验中，Rluc和EYFP结构共表达的BRET比率比上Rluc结构单独表达的BRET比率。
1.&在BRET实验中使用的腔肠素的形式是非常重要的。几种不同形式的腔肠素的存在，每种可以导致稍微不同波长光的峰值发射光。为了能够发生能量转移，供体（Rluc）的发射光谱需要和能量受体（EYFP）的激发/吸收光谱显著重叠。另外，供体和受体的发射光谱必须能够足够的区分，以允许有最小重叠分子的发射光能够分开测量。考虑到这些因素，使用Rluc和EYFP分别作为供体和受体分子，腔肠素的H形式被使用在BRET实验中。腔肠素溶解在甲醇中作为储藏液（500&M）在C20oC下避光保存。仅仅在使用前，腔肠素被BRET试验缓冲液稀释到最终浓度为2&M, 用铝箔包装，以避光。
2.&为了确认BRET信号可以在实验条件下获得，应该使用BRET阳性对照。通过氨基酸连接器分开直接融合的Rluc和 EYFP蛋白是一个很好的BRET阳性对照。通过克隆没有它的终止密码子上游并且添加EYFP编码序列的萤光素酶编码区来准备。然后添加腔肠素到细胞中表达Rluc-EYFP融合。Rluc的发射光直接转移到EYFP,引起了很高的BRET信号，比较从Rluc和 EYFP或单独的Rluc来获得BRET比率
3.&当检测受体和受体，或者受体-蛋白质相互作用的时候，在BRET实验中，使用阴性对照是重要的。包括分别标记了Rluc或者EYFP和未标记EYFP或Rluc受体的表达，来确定BRET信号在相同的细胞中是否仅仅是由于Rluc和 EYFP的过表达。为了评估受体-蛋白质BRET信号的特异性，添加使用其他标记的受体的阴性对照，在这些对照中，标记受体和感兴趣的受体在相似的水平上表达。另外，非标记蛋白可以和供体和受体BRET融合共转染，来破坏他们之间的相互作痛从而降低BRET信号。这个方法适合来评估依靠标记了Rluc或者EYFP的TRHRs的共表达来获得的BRET信号的特异性。
4.&为了确定在TRHRs中是否发生了相互作用（homo- oligomerization），用Rluc或者EYFP来标记TRHRs的C末端产生TRHR/Rluc 或者TRHR/EYFP （5）。
5.&没有BRET信号并不意味着相互作用的缺乏，也可能意味着供体和受体标记不在一个有利于能量转移的方向。Rluc或者EYFP融合了N或者C末端标记的部分感兴趣的蛋白突出的显示了BRET的重要性。使用这种方法，两种分别带有优化方向和距离融合分子的供体和受体的伙伴蛋白的相互作用的组合可以给出更灵敏的BRET信号，可以被确定。在感兴趣的融合EYFP或Rluc的蛋白质之间插入氨基酸连接器序列可能是有用的。当执行BRET来检测受体-蛋白之间的相互作用，受体一般标记在C末端而不是N末端来增加正确折叠和受体膜定位，减少与配体结合干扰的机会。
6.&与非标记蛋白相比，可以评价BRET融合蛋白的功能，当有可能，在使用BRET方法之前。另外，添加Rluc或者EYFP到受体或者感兴趣的蛋白可能干扰表达，折叠，定位 或者蛋白质功能，在评估潜在受体相互作用的相关性前，确定标记蛋白的功能是否受损是非常重要的。为了评估BRET受体融合结构的功能，需要在receptor/Rluc和receptor/EYFP融合子与非标记受体进行比较来进行受体结合和信号实验（5）。相互作用的蛋白（β-arrestin）受体的特性将决定采用何种实验来评估特定感兴趣的蛋白的功能是否保留。在β-arrestin作为感兴趣的蛋白的情况下。β-arrestin/EYFP或Rluc的融合功能进行评估用1）受体内部化试验来测量促进GPCR内部化的能力。2）共聚焦显微镜来监测β-arrestin/EYFP的配体依赖性易位（5）。在转然后48小时，通过使用Mithras LB940 多功能酶标的发光模块测量发光来评估Rluc标记蛋白的表达水平，通过使用Mithras LB940 多功能酶标的荧光模块或者带有荧光活性的流式细胞仪测量荧光来确定EYFP标记蛋白的表达水平。
图2A：测量Rluc表达的发光模块的设置。双击“Read options”对话框下“Measurement”标签左侧的“lumin label”图2A：测量Rluc表
图2B：EYFP表达的荧光模块的设置，双击“Read options”对话框下“Measurement”标签左侧的“fluor label”
7.&在BRET试验方案中已经使用了COS-1细胞。然而，可以在任何细胞类型中进行的BRET也可以进行转染。各种转染试剂和技术可以应用于转染带有cDNA结构的细胞。在我们的手中，使用Polyfect 转染试剂（QIAGEN）可以获得一直的结果。然而，使用的转染试剂要随着选择的细胞类型而变化。
8.&在进行BRET试验时，Rluc比EYFP融合蛋白表达的水平重要。不同数量的Rluc 和 EYFP融合cDNA被传染和实验来决定获得最优化BRET信号的条件。融合蛋白的极限表达是不建议的。因为这可能增加非特异性BRET信号，增强阴性对照如：其他的Rluc和EYFP标记蛋白和感兴趣蛋白在同一水平表达的风险。然而，某些相互作用（低亲和性相互作用）可能需要较高蛋白表达水平来检测。除了蛋白质表达的cDNA转染总数，供体对受体蛋白表达的比率也是很重要的，研究每种蛋白质相互作用的最优化比率需要通过经验来确定。通过滴定的EYFP融合蛋白表达量，同时又保持了Rluc融合表达常数, BRET50（使用荧光计测量EYFP融合蛋白表达，BRET值达到最大值的一半）可以确定为一个相互作用亲和力的相关性的近似措施。GPCRs在异源系统中的过量表达由于这些7TM高度的疏水性可能导致产生不真实的聚集和非特异性的BRET信号（10）。在受体表达的低水平或者在受体的生理水平以下进行BRET,可能有助于防止非特异性BRET信号。但是，蛋白质相互作用可能在相对亲和力方面各有不同，因此为了检测相互作用的BRET信号指示要求不同水平的蛋白质表达和不同比率的供体的受体分子。
9.&能够检测BRET信号仪器的主要特点是具有连续的滤光片，然后在两个不同波长范围进行测量发射光。目前有几种多功能酶标仪可以做这个实验，但是由于光学系统的原因，他们的灵敏度收到很大限制。相反，Mithras是一款多通路光学系统的多功能酶标仪，可以提供测量BRET信号要求的灵敏度（图2，独立光路系统）我们和berthold公司在研发能够测量高灵敏BRET信号的96孔板多功能酶标仪上进行合作。由于遇到上述蛋白质极端表达的问题，因此使用低水平的蛋白质表达如：接近或者低于生理水平，进行BRET实验和检测BRET信号是很重要的。因此，非常期望仪器能有检测低BRET信号，来降低由于BRET融合蛋白高表达带来的非特异性BRET信号。
10.&在添加腔肠素到细胞悬浮液时，由于荧光素酶反应显示快速衰减的动力学。所以需要立即测量发射光。最理想的方法是通过仪器带的试剂注射器来注射腔肠素，
图3A：选择底物和处理的进样器的孔，第四个进样器允许添加多个期望的处理到不同的孔中
图4A：在选择注射孔以后，点击测量标签，双击左边的“dispense”来设置属性
由于BRET信号在添加腔肠后需要几秒才能达到平衡，采取重复读取的所有样本。并且在添加底物后也要执行重复读取，随着时间的推移，可以监测相互作用的稳定性。在监测各种激动剂或者拮抗剂可能对受体-蛋白相互作用的影响的时是特别重要。通过执行重复读取，一个BRET动力学分析正在执行，可以实现实时的监测相互作用。尽管随着时间的推移，发射光的实际数量在减少。阳性对照Rluc-EYFP BRET融合的BRET比率在添加腔肠后保持至少30分钟恒定，
BRET是一种新型的共振能量转移技术，它代表了一个检测和分析广泛的蛋白质相互作用的有力工具，与目前使用的方法相比具有显着优势。它代表了强大的，单一性的活细胞检测系统，它已经成功的应用于研究受体的相互作用，也非常适合于研究任何蛋白质和蛋白质之间的相互作用。
? 黑色和白色Isoplate 96孔板（25块/包）Perkin Elmer 货号
? Mithras LB940 多功能酶标仪
? PBS Powder 10 x 1L Gibco（Invitrogen）货号
? 腔肠（h形式）250ug分子探针货号 C-6780
? EYFP载体-Clontech公司： pEYFP-C1 货号 6005-1，pEYFP-N1 货号6006-1
? Rluc载体-Promega公司：PRL-CMV 货号 E2261
1.&Eidne, K.A., Kroeger, K.M. and Hanyaloglu, A.C. (2002) Applications of novel resonance energy transfer techniques to study dynamic hormone receptor interactions in living cells. Trends. Endocrinol. Metab. 13, 415-421.
2.&Xu, Y., Piston D.W. and Johnson C.H. (1999) A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: application to interacting circadian clock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156.
3.&&Zacharias, D.A., Baird, G.S. and Tsien, R.Y. (2000) Recent advances in technologyfor measuring and manipulating cell signals. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 416-21.
4.&&Angers, S., Salahpour, A., Joly, E., Hilairet, S., Chelsky, D., Dennis, M. and
Bouvier, M. (2000) Detection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cell& using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, .
5.&Kroeger, K.M., Hanyaloglu, A.C., Seeber, R.M., Miles, L.E. and Eidne, K.A. (2001) Constitutive and agonist-dependent homo-oligomerization of the thyrotropin-releasing hormone receptor. Detection in living cells using bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 276, .
6.&&McVey, M., Ramsay, D., Kellett, E., Rees, S., Wilson, S., Pope, A.J. Milligan, G.(2001) Monitoring receptor oligomerization using time-resolved fluorescence resonance energy transfer and bioluminescence resonance energy transfer. The human delta Copioid& Application Note receptor displays constitutive oligomerization at the cell surface, which is not regulated by& receptor occupancy. J. Biol. Chem. 276, .
7.&&Cheng, Z.Y. and Miller, L.J. (2001) Agonist-dependent dissociation of oligomeric complexes of G protein-coupled cholecystokinin receptors demonstrated in living cells using bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 276, .
8.&&Ayoub, M.A., Couturier, C., Lucas-Meunier, E., Angers, S., Fossier, P., Bouvier, M.and Jockers, R. (2002) Monitoring of ligand-independent dimerization and ligand-induced conformational changes of melatonin receptors in living cells by bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 277, .
9.&&Issafras, H., Angers, S., Bulenger, S., Blanpain, C., Parmentier, M., Labbe-Jullie, C., Bouvier, M. and Marullo, S. (2002) Constitutive agonist-independent CCR5 oligomerization and antibody-mediated clustering occurring at physiological levels of receptors. J. Biol. Chem. 277, .
10.&Ramsay, D., Kellett, E., McVey, M., Rees, S. and Milligan, G. (2002) Homo- and hetero-oligomeric interactions between G-protein-coupled receptors in living cells monitored by two variants of bioluminescence resonance energy transfer (BRET): heterooligomers between receptor subtypes form more efficiently than between less closely related sequences. Biochem. J. 365, 429-40.
11.&Yoshioka, K., Saitoh, O. and Nakata, H. (2002) Agonist-promoted heteromeric oligomerization between adenosine A(1) and P2Y(1) receptors in living cells. FEBS Lett. 523, 147-151.
12.&&Lavoie, C., Mercier, J.F., Salahpour, A., Umapathy, D., Breit, A., Villeneuve, L.R., Zhu, W.Z., Xiao, R.P., Lakatta, E.G., Bouvier, M. and Hebert, T.E. (2002) Beta 1/beta 2- adrenergic receptor heterodimerization regulates beta 2-adrenergic receptor internalization and ERK signalling efficacy. J. Biol. Chem. 277, .
13.&Hanyaloglu, A.C., Seeber, R.M., Kohout, T.A., Lefkowitz, R.J. and Eidne, K.A. (2002) Homo- and hetero-oligomerization of thyrotropin-releasing hormone (TRH) receptor subtypes. Differential regulation of beta-arrestins 1 and 2. J. Biol. Chem. 277, .
14.&Mercier, J.F., Salahpour, A., Angers, S., Breit, A. and Bouvier, M. (2002) Quantitative assessment of beta 1- and beta 2-adrenergic receptor homo- and heterodimerization by bioluminescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 277, .
来源：Berthold Technologies中国代表处联系电话：010-1-（上海办公室）
收录时间:日 22:08:55 来源:
上一篇： &(&&)
创建分享人
喜欢此文章的还喜欢
Copyright by ；All rights reserved. 联系：QQ：}