怎样用普通荧光显微镜观察转染的蛋白相互作用 - 实验交流 - 生物秀
标题: 怎样用普通荧光显微镜观察转染的蛋白相互作用
摘要: [怎样用普通荧光显微镜观察转染的蛋白相互作用] 两种质粒，一种是绿色荧光蛋白标记，一种是黄色荧光蛋白标记，同时转染到细胞中，转染后，观察质粒所表达的蛋白的相互作用想问问高手：转染后怎么观察转染效率，在普通荧光显微镜下观察时，用什么颜色的激发光，应该观察到什么样的荧光（就是看到什么现象，就说明相互作用了，什么现象就表示没有相互作用）？麻烦高手啦 关键词:[转染 荧光 荧光显微镜 质粒 荧光蛋白 绿色荧光蛋白 滤光片]……
两种质粒，一种是绿色荧光蛋白标记，一种是黄色荧光蛋白标记，同时转染到细胞中，转染后，观察质粒所表达的蛋白的相互作用
想问问高手：转染后怎么观察转染效率，在普通荧光显微镜下观察时，用什么颜色的激发光，应该观察到什么样的荧光（就是看到什么现象，就说明相互作用了，什么现象就表示没有相互作用）？
麻烦高手啦 金币大大地，不够了，加回复蛋白与蛋白的相互作用不是应该用酵母双杂吗？你用两种荧光标记的蛋白，共转染的话，绿色荧光应该使用蓝光激发，黄色的就不知道了，你可以几个波段的都试试，然后不改变视野的情况下，分别照相，然后使用PHOTOSHOP Merge 一下，不过我觉得应该说明不了相互作用的问题。回复用普通的荧光显微镜的话最靠谱的应该是BIFC了(Bimolecular fluorescence complementation).楼主需要新构建几个质粒, 即分别把荧光蛋白的N段和C段分别接到你要看的蛋白上面.回复楼主做的事FRET？CFP+YFP?此时应当检测CFP荧光损失，使用433 nm激发CFP，如果没有蛋白相互作用，可以检测到CFP本身的476 nm荧光，如果有相互作用，可以看到476 nm荧光减弱，同时检测到527 nm YFP荧光（大概做法就是这样，波长数据是从网上搜的）。要想获得比较理想的结果，需要使用或者配有比较精密滤光片的。
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电话：021-请问构建绿色荧光蛋白表达质粒。 - 实验交流 - 生物秀
标题: 请问构建绿色荧光蛋白表达质粒。
摘要: 请问构建绿色荧光蛋白表达质粒。我想将一片段与绿色荧光蛋白(GFP)质粒构建在一起，然后转染哺乳动物(mammalian)(mammalian)细胞。我的要求是片段与GFP共表达，即有在细胞中若有GFP表达，则表示片段拼接成功。请教用哪一种绿色荧光蛋白质粒比较好？ 关键词:[质粒 绿色荧光蛋白 细胞 转染 哺乳动物]……
我想将一片段与绿色荧光蛋白(GFP)质粒构建在一起，然后转染哺乳动物(mammalian)细胞。我的要求是片段与GFP共表达，即有在细胞中若有GFP表达，则表示片段拼接成功。请教用哪一种绿色荧光蛋白质粒比较好？回复:
我介绍一个是clontech的质粒：
pEGFP-N1 encodes a red-shifted variant of wild-type GFP (1-3) which has been optimized for brighter fluorescence and higher expression in mammalian cells. (Excitation maximum = 488 emission maximum = 507 nm.) pEGFP-N1 encodes the GFPmut1 variant (4) which contains the double-amino-acid substitution of Phe-64 to Leu and Ser-65 to Thr. The coding sequence of the EGFP gene contains more than 190 silent base changes which correspond to human codon-usage preferences (5). Sequences flanking EGFP have been converted to a Kozak consensus translation initiation site (6) to further increase the translation efficiency in eukaryotic cells. The MCS in pEGFP-N1 is between the immediate early promoter of CMV (PCMV IE) and the EGFP coding sequences. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the N-terminus of EGFP if they are in the same reading frame as EGFP and there are no intervening stop codons. SV40 polyadenylation signals downstream of the EGFP gene direct proper processing of the 3" end of the EGFP mRNA. The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T-antigen. A neomycin-resistance cassette (neor), consisting of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex thymidine kinase gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upstream of this cassette (Pamp) expresses kanamycin resistance in E. coli. The pEGFP-N1 backbone also provides a pUC19 origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production.
上面这种是融合表达，还有一种是分开转录表达的。
Identify cells expressing your gene of interest by fluorescence microscopy or flow cytometry.
A gene of interest is inserted into the MCS downstream of the CMV EGFP is transcribed from the SV40 promoter/enhancer, allowing your protein of interest and EGFP to be translated simultaneously from different mRNA transcripts.
Type: Mammalian expression
Promoter: CMV IE
Reporter: EGFP
Selection: prokaryotic— eukaryotic—EGFP
谢谢，不知pIRES2-EGFP怎样。
pIRES2-EGFP contains the internal ribosome entry site (IRES; 1, 2) of the encephalomyocarditis virus (ECMV) between the MCS and the enhanced green fluorescent protein (EGFP) coding region. This permits both the gene ointerest (cloned into the MCS) and the EGFP gene to be translated from a single bicistronic mRNA. pIRES2-EGFP is designed for the efficient selection (by flow cytometry or other methods) of transiently transfected mammalian cells expressing EGFP and the protein of interest. This vector can also be used to express EGFP alone or to obtain stably transfected cell lines without time-consuming drug and clonal selection. 回复:
这几个应该都可以的。
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三种方法转染绿色荧光蛋白质粒的效果评价
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All Rights Reserved绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的.为培育能发出绿色荧光的小鼠.人们设计了如下的流程: 据图回答下列问题: (1)绿色荧光基因通常可以从基因文库中获取.含有一种生物所有基因的文库称为 . (2)A过程是基因工程的核心.常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和 .它们作用的化学键是 .一个基因表达载体的组成.除了目的基因和复制原点外.还必需有 . 以及标记基因 题目和参考答案——精英家教网——
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绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的，为培育能发出绿色荧光的小鼠，人们设计了如下的流程：
据图回答下列问题： （1）绿色荧光基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物所有基因的文库称为___& _____________。 （2）A过程是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和&&&&&&&&& ，它们作用的化学键是___&&& ____。一个基因表达载体的组成，除了目的基因和复制原点外，还必需有&&&&& ___& 、&&&&&&&&&&& 以及标记基因。 （3）B过程常用的方法是____________，进行D过程前，利用____________技术可以获得数目更多且基因型完全相同的绿色荧光小鼠。 （4）也有人设想培育能发光的树，白天做行道树，夜晚做路灯照明。可将荧光蛋白基因导入植物的体细胞中，再利用_______________________技术最终培育成植物体。 （5）在特制的荧光体视显微镜下可以看到，荧光小鼠的皮肤、脑部、肺部发出绿色荧光，可观察胚胎干细胞在体内发育的走向。例如，科研人员将神经干细胞植入小鼠体内治疗帕金森，以前没有荧光鼠的时候，很难分辨打入小鼠体内的神经干细胞与小鼠自身的细胞的不同。现在要研究打入小鼠体内的神经干细胞的走向，简要写出操作思路：&&&&&& ______。
（1）基因组文库 （2）DNA连接酶&&&& 磷酸二酯键&& 启动子& 终止子 （3）显微注射技术&&&&&&& 胚胎分割 （4）植物组织培养 （5）分离培养神经干细胞，将荧光基因表达载体导入神经干细胞，打入小鼠体内，用荧光体视显微镜观察荧光部位。
请在这里输入关键词：
科目：高中生物
来源：生物教研室
1ABC___________
2AB________________AB________
3ABD________D________________
4ABCD__________________________________________________________
__________________________
科目：高中生物
1ABC___________
2AB________________AB________
3ABD________D________________
4ABCD__________________________________________________________
__________________________
科目：高中生物
来源：2013年全国普通高等学校招生统一考试理科综合能力测试生物（北京卷解析版）
题型：综合题
斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验（1）在上述转基因实验中，将G基因与质粒重组，需要的两类酶是&&&&&&和&&&&&&。将重组质粒显微注射到斑马鱼&&&&&&&&&&中，整合到染色体上的G基因&&&&&后，使胚胎发出绿色荧光。（2）根据上述杂交实验推测①亲代M的基因型是&&&&&&&&&&&（选填选项前的符号）。a. DDgg&&&&&&& b.Ddgg②子代中只发绿色荧光的胚胎基因型包括&&&&&&&&&&&（选填选项前的符号）。a. DDGG&&&&& b.DDGg&&&&&&&&& c.DdGG&&&&&&&&&& d. DdGg（3）杂交后，出现·绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代&&&&&&&&&&（填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的&&&&&&&&&&发生了交换，导致染色体上的基因重组。通过记录子代中红·绿荧光胚胎数量与胚胎总数，可计算得到该亲本产生的重组配子占其全部配子的比例，算式为&&&&&&&&&&&&&
科目：高中生物
2008年诺贝尔化学奖授予了三位在研究绿色荧光蛋白（GFP）方面做出突出贡献的科学家。绿色荧光蛋白能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光，这样借助GFP发出的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况，帮助推断蛋白质的功能。GFP基因可作为目的基因用于培育绿色荧光小鼠，下图表示培育绿色荧光小鼠的基本流程，请分析回答：
（1）用于培育绿色荧光小鼠的基因表达载体的组成必需有启动子、________和______。图中过程②常用的方法是_________________；过程③利用的生物技术是__________；迸行过程④前，利用_____________________技术可以获得数目更多且基因型相同的绿色荧光小鼠。 （2）由于GFP基因与其他目的基因一起构建到载体上不影响目的基因的表达，也不影响由目的基因控制合成的蛋白质的结构与功能，且对细胞无毒性作用，因此GFP基因也可以作为基因表达载体上的______________________。 （3）由于荧光蛋白在自然界中不存在，所以科学家通过_________________工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，该工程最终是通过设计________________序列来完成的。
科目：高中生物
题型：单选题
绿色荧光蛋白简称GFP，是由238个氨基酸组成的单链，最初是从维多利亚多管发光水母中分离出来的结构蛋白，会发出绿色荧光。下列有关GFP的说法正确的是A.GFP合成过程中形成了239个肽键B.GFP是由核糖体合成、内质网加工并由高尔基体分泌的，同时由线粒体提供能量C.由于此种蛋白质合成时进行了逆转录的过程，故GFP会发出荧光D.GFP可以整合到细胞膜表面用于标记定位癌细胞
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