小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
&&查看话题
大肠杆菌表达外源蛋白放大遇到的问题
本人用大肠杆菌表达一种外源蛋白，外源蛋白对宿主菌毒性不大，但容易产生包涵体。宿主菌是BL21（DE3）/PET-22b/A9基因工程菌。小试规模蛋白可以正常表达，但等比例放大到50L时蛋白就不表达了，最后发酵液提质粒做pcr，能p出目的片段。但跑蛋白电泳目的蛋白未表达。小罐试过用玉米浆培养基或2YT培养基，都可以表达蛋白。用0.3mMIPTG或1mM也都没有问题。就是一到大罐上就不表达蛋白。试了很多次十分头疼。。。哪位大牛有什么好得意见。O(∩_∩)O谢谢。
小罐是说5L的发酵罐，大罐上的50L的发酵罐，种子是同一批转化的平板上挑的菌、。pH，都是控制在7.0，DO诱导前期出现最低值30%左右。诱导时OD=1,2,2.5都试过都不行。诱导加1mM乳糖16摄氏度诱导16h。。。
现在就怀疑是不是培养基的问题，或者诱导剂乳糖被利用没有起到诱导的作用。
O(∩_∩)O谢谢
怎么诱导剂不用IPTG的？乳糖若是被半乳糖苷酶分解成半乳糖和葡萄糖就没起到诱导作用了。
还有你的诱导od才一二这么低的啊
研究生必备与500万研究生在线互动！
扫描下载送金币
浏览器进程
打开微信扫一扫
随时随地聊科研大肠杆菌转化过程中如何排除假阳性
844286phZD
GET载体的话,用蓝白染色法.抗生素也是一种手段.
那如果用抗生素法的话，具体应该怎么做呢？？
如pBR322。需要做菌落印迹，比较麻烦。
即转入外源基因的，四环素抗体丢失，印迹在四环素培养基上长不出来。挑选原菌落，进行扩增，进一步用分子生物学方法筛选。
为您推荐：
其他类似问题
转化的大肠杆菌是培养于含有X-gal和某种抗生素（如果载体是pBR322，是氨苄青霉素）的培养基中的。由于载体上带有lac Z'，在IPTG的诱导下，能产生半乳糖苷
挑菌做菌液PCR验证，然后提取质粒做酶切鉴定
扫描下载二维码小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
&&查看话题
做大肠杆菌基因敲除遇到的问题
本人用Red重组系统做大肠杆菌的基因敲除，一共敲了两个基因。从抗性筛选平板上挑了长出来的8，9个菌落进行PCR验证，验证的方法就是用两对引物来扩增重组后的片段，比如引物用H1---K1和 H2---K2。结果第一个基因敲除后验证的结果是用H1---K1这对引物PCR的产物很成功，和理想的大小也一致，而用H2---K2这对引物却什么也没P出来； 第二个基因的验证结果也是这样，只不过是用H2---K2能P出来，而用H1---K1没有P出来，这样的结果会不会是假阳性？现在很是担心出来假阳性的问题，但也有可能是PCR 条件的问题，对于第二个基因的验证还有一点奇怪，那就是虽然用H1---K1没有P出来，但是用从耶鲁大学买来的已经敲除成功的菌作模板却P除了很亮的条带, 这个应该不是PCR条件的问题吧？请各位高手赐教！不胜感激！
研究生必备与500万研究生在线互动！
扫描下载送金币
浏览器进程
打开微信扫一扫
随时随地聊科研|/|/|/|/|/|
//|//|//|//|//|
【求助】大肠杆菌的生长问题
前段时间已经构建了突变质粒，用的宿主菌是E.coli JM109，已经做到发酵和分离纯化了。但是近段时间在菌的生长上突然出了问题。先将甘油管里的菌接到LB液体培养基里活化，菌的生长是正常的，OD600能到2，但是将这个LB里长出的菌再接到LB液体里，菌的生长就非常非常少，OD600都不能超过1.35。（菌是抗AMP的，AMP浓度为100ug/ml）以前也是同样的做法，两次LB液体里菌的生长都是一样的。后来便挑了单菌落来培养，挑出来的单菌落接到LB液体，同样长得也不好，生长12h，OD600为1.35。再生长24h或36h后，OD值都没有增加。年前菌无论怎么接生长都是没有问题的，可是现在长得，一看就稀稀拉拉，也不知道什么原因，希望能有有经验的大虾指教。谢谢了先。。。LB没问题吗？关注..............LB没有问题的，因为从甘油管接出的菌用同样的培养基就能长的很好。而再用甘油管接的LB里的菌再接LB，OD值就怎么都上不去了。。。好郁闷哦，实验都进行不下去了。。。将你的甘油管菌种先接到固体选择培养基上传两代之后再接到液体里试试，传代时间控制在一天之内，就是涂菌之后生长一天就传代。哦，谢谢楼上的，我先试试看。。。不过之前我已经试过用平板筛选单菌落传代了，结果还是不如人意。。。希望这次能够成功了。。。路过，很难的问题啊，可以直接接一代种液上发酵看看酶活如何？还是不行啊。还望大侠们支招啊。。。实验进行不下去了。。。是不是两次培养的培养基的某些成分换过了？不同匹次的培养基可能会影响很大是不是接种量的问题，接种量过大或过小都会影响生长速度。少见的问题，关注中ing你的接种量和菌种/LB比例多少？特别是第二次的。甘油菌用接种环在LB固体平板上划线接种，过夜培养后，挑取线上的单菌落液体LB培养，7-8 hours后，按照1:100的比例转接到新的LB液体培基中，看看怎么样。另外，你的目的基因是什么？有时候这个也很有影响的。同意楼上的lxai122 wrote:甘油菌用接种环在LB固体平板上划线接种，过夜培养后，挑取线上的单菌落液体LB培养，7-8 hours后，按照1:100的比例转接到新的LB液体培基中，看看怎么样。另外，你的目的基因是什么？有时候这个也很有影响的。对您的这个疑问非常同意 目的基因表达后会对宿主有毒性也说不定 我特意做过试验
JM109甘油菌用接种环在LB固体平板上划线接种，过夜培养后，挑取线上的单菌落液体LB培养，16 hours后，按照1:100的比例转接到新的LB液体培基中，7hours后OD600即可达3.0。本人考虑是不是你的连接入质粒的片断，影响到了氨苄抗性基因的表达，这种原因才是最常见的，因为一个片断的插入，影响到其他基因的表达是普遍的，在基因组DNA中存在，同样在质粒中也存在，基因的插入影响到基因表达这种情况遇到过，但是不是关于抗性筛选方面的！
因为你插入的位点虽然不影响密码子，但是有可能影响表达的调控！
解决方法也很简单，降低氨苄的浓度，不知道为什么你会用100ug/ml，通常都是用50ug/ml，你可以先用50ug/ml试试，不行可以再降低些，如果是不产酶的，在10ug/ml的时候都不能生长，这个筛选是可行的！
您的位置： &&}