连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少，请问有哪些原因？怎样解决？ - 赢润生物小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
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一个关于感受态转化的问题
各位战友，大家在使用真核载体连接产物转化感受态后，是否也有转化效率低下的问题啊？
我用的是pmirGLO双荧光报告载体，大概7K多bp，感受态是ECOS的。转化步骤是传统步骤：冰浴5min，42℃热击45s，冰浴1min，涂板。
可是一直以来板子上长的菌要么是非常少，要么根本不长。
各位战友有没有遇到过相似情况的？大家有没有啥好办法咧？
交流一下，让彼此的试验更加顺利哈~~
加了1μg/ml的氨苄，你们呢？
我们用的浓度是50ug/ml，你的1ug写错了吧？
呃。。。写错了，是1μl/ml
还是不对啊，你的实验做出来了么
请问你的连接体系以及转化方法是怎样的啊？
就是一毫升培养基里加一微升氨苄。
我们用的是商品化的快速转化感受态，不需要复苏
我知道你用的是快速感受太，我们也用的这个，氨苄平板的浓度是25-50ug/ml才好用，卡那的浓度得是25ug/ml，而且还得复苏才行。
恩 我们的是50μg/ml，不过没复苏。我今天复苏一板试一试吧。谢谢啦
氨苄不复苏就行，卡那一定要复苏
是氨苄的，昨天复苏了一小时，果然长菌了，长菌了:arm::hand::cry:两个礼拜了啊，终于前进了
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随时随地聊科研连接转化的问题(菌落,表达载体连接,感受态细胞,空载体) - DNA技术 - 生物秀
标题: 连接转化的问题(菌落,表达载体连接,感受态细胞,空载体)
摘要: [连接转化的问题(菌落,表达载体连接,感受态细胞,空载体)] 外源片段与表达载体连接后，一般取几微升转化感受态细胞，空载体对照转化后是否应该无菌落或有少量菌落？ 关键词:[菌落 表达载体连接 空载体 感受态细胞]……
外源片段与表达载体连接后，一般取几微升转化感受态细胞，空载体对照转化后是否应该无菌落或有少量菌落？
回复不知你的载体是什么？载体不同，结果会有所不同。按照我用pUC119做转化的经验，一般是取十微升转化感受态细胞，不过我每次的连接体系也就是十微升。空载体做对照转化后，如果转化效率高的话，一样会出现很多菌落。只是空质粒转化后出现的是蓝斑。回复我用的是PET28A 载体，我转了一次，加10ul，仅出现3个菌落，而空载体对照则没有菌落。没有蓝白斑筛选，只有卡那筛选。回复既然两者都没有出现菌落或菌落很少（3个），那肯定是转化率的问题，请验证你转化的过程中有没有出什么错误。PET28A空载体转化也一样会出现菌落，因为它本身是带卡那抗性的。回复我一般从10微升连接体系中取5微升做转化,剩下5微升跑电泳观察连接情况,如果连接的好,载体和目的基因的片段消失或变暗,空载体对照应该是有细菌生长的,主要是看你的转化效率,但是你也要做个不加卡那的平板,用你的感受态细胞做对照看你的感受态细胞做的好坏.回复用PET28A 载体作连接转化,不知你用的是什么克隆菌株,一般是DH5a或JM109,这两种菌株都长的比较慢,而且转化效率较低.通常的转化后长菌时间是10-16小时,但这两种菌可能要长20小时以上.空载体比连接产物效率高的多,而且空载肯定会长出菌.你做的空载无菌,首先说明你的感受态效率差,连接产物长的三个菌很可能是杂菌.在保证感受态效率之后,就是看你的连接是不是有问题了.我们一般用10ul作转化.但不知你的外源片段多大,与表达载体酶切是否完全,以何种方法回收,与载体又以多少比例进行连接,还有连接的时间是多少?这些都决定了你的连接是否成功,希望能说具体些.回复在保证感受态效率之后,就是看你的连接是不是有问题了.我们一般用10ul作转化.但不知你的外源片段多大,与表达载体酶切是否完全,以何种方法回收,与载体又以多少比例进行连接,还有连接的时间是多少?这些都决定了你的连接是否成功,希望能说具体些.我的感受态是promega的jm109,以前转过质粒没问题,外源片段1500bp,与表达载体酶切完全相同,利用takala的胶回收试剂盒,连接比例载体1ul,外源片段4ul,连接时间16度20小时.谢谢各位的回复!回复jm109长的就更慢了，感受态的要求就更高了。你的片断连接看来没什么问题，就好好做感受态吧。回复我用的是pGEX4t-1的载体，外源片段900bp左右，用BamHI和EcoRI双酶切。我想请教各位大虾，我做连接的时候需要连多长时间？需要取多少体积做转化？回复这是普通的GST表达载体，同常规一样，载体与片断的比例为1：4，16度连接10到20小时。不过BamHI和EcoRI位点离的太近，双酶切效率不知会不会差点，你最好切足3小时。
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[导读]我们选用萤火虫荧光素酶表达载体检测转录活性主要有如下的优点：荧光素酶的测定非常灵敏，不需要放射性物质
王春红&& 李哲&& 王明菡&& 邓丽丽&& 王欢
　　[摘& 要] 目的：本研究通过克隆人多巴胺受体（dopamine receptor，DRD）1基因的启动子区，构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性，为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。方法：以人静脉血基因组DNA为模板，通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体，测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic，构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，采用阳离子脂质体法与内对照质粒pGL3-TK共转染人真核细胞系HEK-2293，同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与内对照质粒pGL3-TK共转染作为阴性对照组，化学发光仪检测相对荧光强度。结果：通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确。与阴性对照组相比，该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性。结论：成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体，为研究该基因的转录调控提供了基础工具。
　　[关键词]多巴胺受体D1基因&& 双荧光素酶报告基因&& 启动子&& 克隆
　　DOI:10.3760/cma.j.issn.15.32.25
　　作者单位：110034，辽宁沈阳，沈阳医学院公共卫生学院毒理教研室
　　多巴胺作为一种内源性神经递质，主要通过多巴胺受体调控其功能。多巴胺受体是能与多巴胺特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质。多巴胺受体（dopamine receptor, DRD）为七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前已分离出五种类型（DRD1～DRD5）。人类DRD五种亚型的基因位于不同的染色体上。DRD1基因位于第5号染色体短臂37区5带（5p37.5），全长3489bp [1]。人和大鼠的DRD1基因编码产物均为466个氨基酸，其同源性为91%，而跨膜部分的同源性为96%。DRD1受体基因的mRNA在纹状体、伏隔核和嗅结节等部位表达丰富，这些区域中DRD1受体的表达量也非常高 [2]。DRD1基因启动子区的多态性位点会通过调控转录活性来影响多巴胺受体1的产量，进而影响多巴胺神经递质的代谢，有研究发现该基因启动子区的核苷酸多态性位点可能与精神分裂症，双相情感障碍等疾病的发生有关 [3-7]。
　　目前，对DRD1基因启动子区的研究甚多，但仍未得出一个统一的结论，且很多研究多局限在对单独某一位点与疾病的回顾性分析，并未对具体调控做细致的分析。本研究拟通过构建含有DRD1基因启动子区序列的荧光素酶报告基因载体，细胞转染验证其表达活性，为进一步深入研究该基因的转录调控机制提供基础工具。
　　材料与方法
　　人DRD1基因启动子克隆
　　取枸橼酸钠抗凝的人静脉血3ml置于试管中，应用酚-氯仿法提取基因组DNA，所得DNA沉淀加适量的TE（10mol/L Tris-HCl, 1mol/L EDTA pH8.0）溶解，溶解后的DNA于4℃保存。
　　应用Primer 5.0软件设计特异性引物，根据pGL3-Basic载体（Promega，美国）多克隆位点选定限制性内切酶（见图1）。
　　划线部分分别为Kpn1 和Bgl2的酶切识别位点，引物委托生物公司合成（TaKaRa，大连）。PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；变性 95℃& 1min，复性 60℃& 30s，延伸 72℃ 2min10S，循环35次；终末延伸72℃ 5min。扩增片段长度2001bp（-1990～+10）。采用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物。紫外光下切胶，并按照Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）说明书的操作步骤进行纯化。纯化后的PCR产物通过DNA A-Tailing Kit（TaKaRa）在3&端加一个碱基A后与pGM-T载体（天跟，北京）连接，转化感受态细胞TOP10（天跟），Kpn1 和Bgl2（Thermo，美国）双酶切及测序验证插入的片段。验证无误的质粒在双酶切后切胶纯化，与pGL3-Basic载体的连接。使用无内毒素质粒大量提取试剂盒（博迈德，北京）提取重组后的报告基因质粒，内对照质粒pGL3-TK和阴性对照质粒pGL3-Basic。
　　HEK293细胞于DMEM/高糖培养基（含10%胎牛血清）（Hyclone，美国），37℃，5%CO2浓度，100%相对湿度条件下培养。将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic稀释至100ng/&l，内对照质粒pRL-TK稀释至10ng/&l；然后将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic与内对照质粒pRL-TK按5:1,10:1,20:1混合。选择对数生长期细胞接种于24孔板（1&105/孔），待细胞生长密度达80-90%，且分布均匀即可进行转染。使用Lipofectamine? 3000（Invitrogen，美国）转染，转染后培养6h后更换新鲜的DMEM培养基，转染后的24h收集细胞。
　　双荧光素酶活性分析
　　将上诉24孔板中的细胞用500&l1&PBS洗涤一次，弃液，加入100&l新鲜配置的1&PLB裂解液。与室温下在摇床震荡20min以充分裂解细胞。在0.5ml检测管中依次加入100&l LAR2溶液，20&l裂解液，混匀后将检测管放入Lumat3 LB9508管式发光检测仪（Berthold，德国）检测孔中，延迟3s，检测时间10s，测定出萤火虫荧光素酶的活力，然后在检测管中加入100&l新鲜配置的1&STOP液，混匀后再检测海肾荧光素酶的活力。计算两种荧光素酶的活力比值，即相对荧光强度。
　　用PCR扩增和DNA重组技术，将5&端调控区片段（-1990～+10）定向克隆到pGL3-Basic质粒中，构建重组的荧光素酶报告基因质粒。重组质粒经过Kpn1 和Bgl2限制性内切酶的双酶切后，酶切片段长度2001bp，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图2，酶切片段的长度与设计长度一致。测序结果显示插入片段与目的片段的序列完全一致。
　　重组质粒的荧光素酶活性分析
　　以pRL-TK载体作为转染的内参，pGL3-Basic载体作为荧光素酶活性的阴性对照，测定DRD1基因5&端启动子区的重组载体转染人胚肾293细胞后的荧光素酶相对活性。实验结果表明 DRD1基因5&端启动子区重组载体能表达荧光素酶。细胞共转染的效率受多种因素的影响，如细胞密度、脂质体和质粒的比例以及两个质粒之间的比例等，为了优化重组载体和内对照载体的比例，本实验使用3种不同比例进行共转染后发现以10:1比例转染的效果最好（图3）。
　　本研究选择位于起始密码上游的片段作为目的片段（-1990～+10），片段长度2001bp。通过对pGL3-Basic载体多克隆位点的查阅，我们选择Kpn1 和Bgl2限制性内切酶识别位点来构建克隆载体。由于待插入的片段较长，我们先通过TA克隆筛选出具有黏性末端的片段，再与表达载体进行连接。因为TA克隆简单，成功率高，PCR扩增产物通过加A反应在末端加一个碱基A，而T载体的缺口有一个凸出的T，正好可以配对。该TA克隆技术比其他的PCR克隆方法有更高的重组效率，一般超过90%的阳性克隆含有目的DNA片段 [8,9]。
　　我们选用萤火虫荧光素酶表达载体检测转录活性主要有如下的优点：荧光素酶的测定非常灵敏，不需要放射性物质；其分析的线性范围可以超过8个数量级，因此少量细胞的裂解产物就可以满足实验需要；荧光素酶分析还可以在96孔板里进行，方便大量转染细胞后的测定。在双荧光素酶报告基因系统中，以TK启动子转录的海肾腔肠荧光素酶作为内对照，可以降低细胞数目和状态、转录和裂解效率等差异造成的误差，使得结果更加可靠和准确[10,11]。
　　人HEK293细胞系胚胎肾细胞经腺病毒DNA剪切后转化而来。免疫染色，免疫印迹和微列阵分析表明该细胞表达神经丝（neurofilament，NF）亚基，NF-L，NF-M和NF-H以及通常在神经元表达的许多蛋白质 [12]。这表明此细胞和神经元会有意外的关联，也可能具有更多神经元特性的转录因子。而另一个可能的解释是与神经细胞系相比，该细胞生长代谢速率更快，因而在转染后的相同时间内，荧光素酶产量更多。
　　综上，本实验构建了含人DRD1基因启动子区的双荧光素酶报告基因系统，通过转染人真核细胞HEK293验证了其具有较强的转录活性，为进一步研究DRD1基因表达及转录调控机制提供了基础工具。
　　参考文献：
　　[1]Grandy D K, Zhou Q Y, Allen L, et al. A human D1 dopamine receptor gene is located on chromosome 5 at q35.1 and identifies an EcoRI RFLP. Am J Hum Genet. 8-834.
　　[2]Kato T. Molecular genetics of bipolar disorder and depression. Psychiatry Clin Neurosci. -19.
　　[3]Dollfus S, Campion D, Vasse T, et al. Association study between dopamine D1, D2, D3, and D4 receptor genes and schizophrenia defined by several diagnostic systems. Biol Psychiatry. 9-421.
　　[4]Zhang C, Xie B, Du Y S, et al. [Gene-gene interaction between DNMT3B and DRD1 in schizophrenia]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 59-3062.
　　[5]Howe A S, Leung T, Bani-Fatemi A, et al. Lack of association between dopamine-beta hydroxylase gene and a history of suicide attempt in schizophrenia: comparison of molecular and statistical haplotype analyses. Psychiatr Genet. 0-115.
　　[6]Del Zompo M, De Luca V, Severino G, et al. Haplotype association study between DRD1 gene and bipolar type I affective disorder in two samples from Canada and Sardinia. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. B: 237-241.
　　[7]Zhao L, Lin Y, Lao G, et al. Association study of dopamine receptor genes polymorphism with cognitive functions in bipolar I disorder patients. J Affect Disord. : 85-90.
　　[8]Yasuda J. [TA cloning: a rapid and efficient method for cloning of the PCR products]. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 8-521.
　　[9]Zhou M Y, Gomez-Sanchez C E. Universal TA cloning. Curr Issues Mol Biol. -7.
　　[10]Liu W, Chen W, Zhang P, et al. Molecular cloning and analysis of the human PCAN1 (GDEP) promoter. Cell Mol Biol Lett. 2-492.
　　[11]Jiang A L, Zhang J Y, Young C, et al. Molecular cloning and characterization of human homeobox gene Nkx3.1 promoter. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). -67.
　　[12]Bussow K. Stable mammalian producer cell lines for structural biology. Curr Opin Struct Biol. -90.}