核酸杂交技术(Northern Blot、Southern Blot和探针标记）_医药保养_中国百科网
核酸杂交技术(Northern Blot、Southern Blot和探针标记）
    　　（一）Southern Blot 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。（二）Northern Blot 在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
　　（一）Southern Blot
　　原理：
　　将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
　　用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot
　　原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
　　用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术
　　1 标记物：放射性和非放射性两种
　　放射性：
　　非放射性：生物素、地高辛素、荧光素
　　2、标记方法
　　（1）切口平移法
　　（2）随机引物法
　　（3）末端标记法
　　（4）单链 DNA探针标记
　　（5）寡核苷酸探针标记法
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Southern&northern&western杂交原理
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Southern Blot原理及实验方法
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Southern 杂交操作步骤及注意事项
Southern 杂交操作步骤及注意事项
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六、杂交 Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方： PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42℃。 1. 预杂交 NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。 2. 杂交 倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。 七、洗膜与检测 取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜： 2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。 在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。 影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。 八、注意事项 1. 要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段（大于15kb），可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。 2. 转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。 3. 转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。 4. 注意同位素的安全使用。
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【求助/交流】southern blot 转膜
昨天做了转膜，今早剥下以后，膜拿去固定去了，胶又去染色看了下，发现还有很多没转过去，哎，是不是就意味着又失败了。之前几次转膜都没这样情况，高手指点下啊，大概什么原因。
我有时候也会出现探针过量，但是能杂出条带，楼主不妨做一下斑点杂交预实验，如果探针和目的片段能杂出信号，和样品杂不出信号，可能是样品有问题。祝好运。
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