[请教]:测蛋白酶活性对照管和测试管差别太小 - 实验交流 - 生物秀
标题: [请教]:测蛋白酶活性对照管和测试管差别太小
摘要: [[请教]:测蛋白酶活性对照管和测试管差别太小] 我做的是鱼类的一种细菌嗜麦芽寡养单胞菌的胞外蛋白酶的酶活测定。方法是利用福林酚法，以酪蛋白为底物。1、先将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中预热3-5min。2、将培养的细菌冷冻离心，取上清液做待测样品（经脱脂奶平板测定上清液具蛋白酶活性）。3、取1ml在40℃预热的样品加入已预热的酪蛋白溶液1ml，准确反应10min。4、10min后加入2ml 0 4mol L三氯乙酸终止反应，立即摇匀，取出后 关键词:[预热 酪蛋白 蛋白酶 活性对照 上清液]……
我做的是鱼类的一种细菌嗜麦芽寡养单胞菌的胞外蛋白酶的酶活测定。方法是利用福林酚法，以酪蛋白为底物。1、先将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中预热3-5min。2、将培养的细菌冷冻离心，取上清液做待测样品（经脱脂奶平板测定上清液具蛋白酶活性）。3、取1ml在40℃预热的样品加入已预热的酪蛋白溶液1ml，准确反应10min。4、10min后加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸终止反应，立即摇匀，取出后静置10min。5、过滤，取滤液1ml加入5ml碳酸钠，再加入1ml福林试剂40℃显色20min。对照管的做法与测试管一致，只是先加入三氯醋酸，再加入酪蛋白。显色完成后于680nm处721型分光光度计测OD值。我曾经怀疑是温度的问题，但今天也作了不预热，于常温25℃反应，但结果还是差别很小。测试管OD值为0.763，对照管为0.731十分感谢各位！！！
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测定蛋白酶活力实验
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&&测​定​生​物​蛋​白​酶​分​解​物​质​活​力
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请问各位大神，常用的蛋白酶抑制剂都有什么？
我要用在保存酶标抗体和蛋白标准品上面
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inhibitor&&&&&&&&&&&&&&& target&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
Aprotinin&&&&&&&&&&&& trypsin，chymotrypsin plasmin
Leupeptin&&&&&&&& lysosomal
pepstatin A&&&&&&&&&&& Asp& proteases
EDTA&&&&&&&&&& Mg,Mn metalloproteases
EGTA&&&&&&&&&&&&&& ca metalloproteases
NaF&&&&&&&&&&&&&&&&& ser.thr phosphatase
orthovanadate& thr phoshatases
pyrophosphate&&&&&&&&& ser,thr phospharase
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苯甲基黄酰氯（phenylmethyl sulfonyl fluoride， PMSF），我做蛋白表达纯化的时候用的这个，剧毒，用的时候要注意
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目标酶家族
（溶剂系统）
AEBSF&#8226;HCl
丝氨酸蛋白酶
200mg/ml(水)
抑肽酶（Aprotinin）
丝氨酸蛋白酶
10mg/ml(水)
抑氨肽酶（Bestatin）
5mg/ml(甲醇)
焦磷酸钠（Sodium
Pyrophosphate）
丝氨酸/苏氨酸磷酸酶
65mg/ml(水)
半胱氨酸蛋白酶
20mg/ml(1:1 乙醇/水)
金属蛋白酶
(螯合二价阳离子)
10克/100ml(水)
亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）
丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶
1mg/ml(水)
胃酶抑素A（Pepstatin A）
天冬氨酸蛋白酶
1mg/ml(甲醇)
PMSF (苯甲磺酰基氟化物)
丝氨酸蛋白酶
18mg/ml(甲醇)
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木瓜酶和胰酶
1mg/ml水溶液
对胰凝蛋白酶，胃液素，纤溶酶无影响
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶
10-40μg/ml或10-20μM
100mmol/L水溶液
毒性比PMSF低，不能抑制胰凝蛋白酶或乙酰胆碱酯酶
丝氨酸蛋白酶
0.06-2μg/ml
10mg/mlPBS溶液
避免反复动冻融
不能抑制羧肽酶
Calpain抑制剂Ⅰ、Ⅱ
(钙依赖性半胱氨酸蛋白酶)
Ⅰ:17μg/ml
Ⅱ:7μg/ml
可渗透薄膜
抑糜朊酶素
胰凝乳蛋白酶
6-60μg/ml
B.M.综合酶片
丝氨酸，半胱氨酸和金属蛋白酶
每10-50ml细胞提取液内加一片
金属蛋白酶
0.2-0.5mg/ml或0.5-1.3μmol/L
500mmol/L水溶液pH=8.0
抑蛋白酶醛肽
丝氨酸蛋白酶，巯基蛋白酶
0.5-2μg/ml
10mg/ml水溶液
a2 -巨球蛋白
100∪/ml PBS 溶液
避免接触还原剂
Pefabloc SC(boe- hringer
丝氨酸蛋白酶
0.1-1.0mg/ml或0.4-4mmol/L
100mM水溶液
无毒，在中性pH下较PMSF 稳定
胃蛋白酶抑制剂
酸性蛋白酶
1mg/ml甲醇溶液
丝氨酸蛋白酶
17-170μg/ml
10mg/ml异丙醇溶液
每一操作步骤时新鲜加入
37-50μg/ml
1mg/ml溶于50mMmol/L醋酸盐溶液，pH=5.0
对胰凝蛋白酶无影响
胰凝乳蛋白酶
70-100μg/ml
3mg/ml乙醇溶液
对胰蛋白酶无影响
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蛋白酶活性检测方法大全
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来源：互联网
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解析蛋白酶活性测定 聚焦蛋白酶研究新进展
1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/ mL)表示。
2 福林法(第一法)
蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。
2、2 试剂和溶液
2、2、1 福林试剂的制备
于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
2、2、2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L
按GB601配制。
2、2、5 盐酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L
按GB601配制。
2、2、6 缓冲溶液
a、磷酸缓冲液
(PH=7.5)适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶
甲液 称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液 称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液(PH=10.5)适用于碱性蛋白酶
甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述各种缓冲溶液，均须用PH计校正。
2、2、7 10g/L酪素3)溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中
边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
注：3)酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。
2、2.8 100ug/mL L-酪氨酸4)标准溶液
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/ mL酪氨酸标准溶液。
注：4)L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。
b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。
2、3 仪器和设备
2、3、1 恒温水浴 40±0.2℃。
2、3、2 分光光度计
应符合GB9721的规定。
2、4 分析步骤
4、1 标准曲线的绘制
a、L-酪氨酸标准溶液
酪氨酸标准溶液的浓度
取100ug/ mL酪氨酸标准溶液的体积
取水的体积
b、分别取上述溶液各1.00 mL(须做平等试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂使用溶液1.00 mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。
根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。
(1)待测酶液的制备
a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00 mL)，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25～0.40范围内)。
b、酶粉测定时，稀释倍数参考表A4(液体酶亦可参照表A4稀释)。
第一次稀释
第一次稀释
2g 200 mL（100倍）
5 mL 100 mL（20倍）
2g 500 mL（100倍）
5 mL 50 mL（10倍）
2g 200 mL（100倍）
5 mL 200 mL（40倍）
2g 500 mL（100倍）
5 mL 100 mL（20倍）
2g 500 mL（100倍）
5 mL 200 mL（40倍）
a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5
b、按下列程序操作：
试管A(空白) 试管B(酶试样，需作三个平行试样)
加酶液1.00 mL 加酶液1.00 mL
40±0.2℃，2min
加三氯乙酸2.00 mL(摇匀) 加酪素1.00mL(摇匀)
40±0.2℃，10min 40±0.2℃，10min
加酪素1.00(摇匀) 加三氯乙酸2.00mL(摇匀)
取出静止10min，过滤 取出静止10min，过滤
取1.00mL滤液 取1.00mL滤液
加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL
加福林试剂使用液1.00mL 加福林试剂使用液1.00mL
40±0.2℃ 显色20min 40±0.2℃ 显色20min
于680nm波长，用10mm比色皿 于680nm波长，用10mm比色皿
测其吸光度 测其吸光度
c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4、2(2)。标准曲线作同样处理。
X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n…………………(A3)
式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL);
A——样品平行试验的平均吸光度;
K——吸光常数;
4——反应试剂的总体积，mL;
10——反应时间10min，以1min计;
n——稀释倍数。
所得结果表示至整数。
6 结果的允许差
平行试验相对误差不得超过3%。
紫外分光光度法(第二法)
蛋白酶在一定的温度与PH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。
2 试剂和溶液
3 仪器和设备
3、1 恒温水浴40±0.2℃。
3、2 紫外分光光度计 应符合GB 9721的规定。
4 分析步骤
4、1 求K值
按第一法( 4、1a)的表A3配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算K值(其K值应在130～135)范围内)。
4、2 待测酶液的制备
a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取酶液1.00 mL),以下操作同A2`4`2中(1)a;
b、测定酶粉时稀释倍数参考表A5(液体酶亦可参照表A5稀释)。
第一次稀释
第二次稀释
1g 200mL（200倍）
1g 200mL（200倍）
10mL 100mL（10倍）
5mL 100mL（20倍）
除酶液吸取2.00mL、酪素吸取2.00mL、三氯乙酸吸取4.00 mL外，其它操作条件同福林法测定( 4、2)中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度(A)。
X=A×K×8/2×1/10×n=2/5×A×K×n×E…………………(A4)
式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL);
A——试样溶液的平均吸光度;
K——吸光常数;
8——反应试剂的总体积，mL;
2——吸取酶液2.00mL，以1min计;
1/10——反应时间10min，以1min计;
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50;酸性蛋白
酶系数为0.77)。
所得结果表示至整数。
7 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3%。
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