Western-blot实验中，蛋白上样一般多少含量_百度知道【求助】western blot的最大上样量 - 经验共享 - 分析测试百科网 - 分析测试百科网
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【求助】western blot的最大上样量
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目标蛋白表达量少,想上样达到最大,请问最多能上样多少ug,而且蛋白条带不会弥散,
有人说只能90ug,但是,我上样到90,依然条带很浅细,几乎照不出来.请大家指教查看完整版本请点击这里：
kuohao17 ( 16:59:27)
个人感觉没关系吧，你先多上点，即便一开始弥散也没关系啊，能做出来再说做的漂亮，你觉得呢？
c86v ( 16:59:46)
使用1.5mm厚的胶，最大上样体积可以达到50ul。通过浓缩蛋白溶液，我上到150ug，条带依然很清楚。建议先用胰酶将细胞消化下来，同时采用并组，多收集一些细胞，再加少量细胞裂解液，即可达到浓缩蛋白的目的，上样量亦可提高
greenbee ( 17:00:04)
According to some referances, proteins transfered to the membrane from the SDS-PAGE gel may be refolded at least partially. This may be part of the reason for the recognition of the Ab and Ag.
yonger ( 17:00:20)
上样量的最大量不是以质量来算的，是体积问题吧！关键是你的蛋白浓度，要想条带好看可能0.75比1.5的好,上样量的多少就要靠你的蛋白浓度了，一般1.5的胶最多上50—60ul的样，而且很容易就溢出来了反而影响结果，建议使用蛋白浓缩试剂盒浓缩样本。还有就是建议6X的sample buffer比2x的好。如果内参都出不来，真的是提取的蛋白有问题了，是不是蛋白提取液太多，组织/细胞太少！
huifeng0516 ( 17:00:51)
楼上的大侠，我的内参也发不出来，但是目的蛋白很清楚，是不是提蛋白有问题呢
BUK ( 17:01:14)
上样量最大的问题，我个人理解是其实没有关系的，只要胶做的没有问题，你完全可以做一个浓度梯度的条件摸索的，比如100，150，170，200ug的上样量，哪个条带跑的有弥散了，就知道哪个是最大上样量了。我有时候上样量达到100条带弥散了，有时候又很好，所以个人觉得还是跟做的胶有一定的关系，还有就是空的泳道要加loading buffer填充才不会弥散。
911 ( 17:01:49)
“我的内参也发不出来，但是目的蛋白很清楚，是不是提蛋白有问题呢 ”
我觉得可能是你内参的抗体问题，看看实验室其他人用相同的抗体有没有问题，要不就换个内参看看，不要耽误时间！
redbutterfly ( 17:02:07)
我用60微升的,效果不错。不过我建议你多收集样本，少加裂解液。
101010 ( 17:03:38)
WB还算一个很灵敏的实验，如果上样量过大，相对而言结果的说服力就降低了。建议首先从样本中目标蛋白的收集这一步做起。如果是外源蛋白，增加表达的效率，如果是内源蛋白，注意一下收集时间（有些蛋白很快就在体内被降解了）。然后裂解时的体系不要太大，保证蛋白浓度。上样前定一下量，如果稀到了必须狂上样，还是趁早重做。
另外，梳子可以自制。我们师兄自己作的梳子能上120微升。
当初我开始WB的时候，上样很多，被师兄训阿……
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【求助】Western-blot实验中，蛋白上样一般多少含量．
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　　最近一直做，可是由于蛋白含量多，故加完样后，效果不好，请教帮助！
不知道邀请谁？试试他们
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你表达的蛋白多的话,上样量要适当减少!如果表达量在40%左右,用5微升就够了!多了,带太宽,效果不好
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薄板30~40ug左右，带型较漂亮
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蛋白上样的量其实没有定制，一般来说每个泳道20微克蛋白就可以检测了，但是，如果你要检测的蛋白本身表达不多的话你就得相应的增加蛋白量。另一方面，如果你的玻板用的是1.5毫米厚的那就得在1.0毫米厚的蛋白量的基础上相应的加20%左右的蛋白。
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上样量一般根据目的蛋白的丰满度有关系的，我们做细胞的时候一般用10~30ug就可以了，组织要多一些，30~~60ug差不多了
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怎么样才知道我的蛋白要上样多少比较合适呢？
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就是怎么样知道目的蛋白的丰度？
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这需要自己查文献和摸索
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