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带GST标签的融合蛋白的纯化问题——急急急
请教各位高人们：我表达了一个带GST标签的融合蛋白，原核表达在上清中，可用GST纯化柱进行纯化时，就是结合不上去，蛋白全部都跑到第一流出液中去了，高人们给分析一下是什么原因呢，在此先谢谢各位了，期待大家的回复哦。。。。。。。。
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GST标签蛋白纯化原理
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GST标签蛋白纯化原理
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GST 标签蛋白纯化工具
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&&GST 标签融合蛋白
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【求助】关于GST融合蛋白的纯化
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【求助】关于GST融合蛋白的纯化
我得到的GST融合蛋白主要在包含体中，15ml菌液超声裂菌后用4M盐酸胍洗涤，再用6M盐酸胍溶解蛋白，后进行稀释复性，利用sepherose 4B纯化，跑SDS－PAGE，条带都没有marker清楚，不知怎么回事
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用GST的抗体鉴定倒底有没有?
而且15mL菌太少了,多摇点吧.
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我的蛋白也是GST标签的,已经得到阳性克隆了,但是怎么样都表达不好,一直找不到最佳表达条件,有的时候甚至都看不到明显的表达,很郁闷,实验也卡住了。我的蛋白加上GST标签有77kda。
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我以前也做过GST纯化。但是效果很差，很大一部分原因就是因为我表达的是包含体蛋白，不是可溶性蛋白。你效果差的原因除了初始浓度低，很可能是因为蛋白复性不好。因为gst纯化主要就是利用酶和底物相结合的原理来纯化的，如果复性不好，自然就很难结合。不知道你的稀释复性效果怎么样，反正我试过稀释复性、过柱复性、透析复性，效果都不太好。包含体复性的影响因素很多，也很复杂，版内有专门讨论的。我后来尝试后，还是放弃了纯化。
不知道你是纯化蛋白干嘛的，如果只是为了制备抗体，完全可以切胶回收。如果是为了做蛋白功能（我就是想做功能，才尝试可溶性表达载体），那么建议你经过摸索后，如果得不到好的结果，尝试其他可溶性表达载体，或酵母表达系统（你那应该是真核基因吧）。因为复性实在是不好做啊，浪费时间。
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我是要做功能实验，纯化不出来啊
我用的是sepherose 4B，我看说明书上写着在6M盐酸胍1h，珠子的结合能力没什么大的影响，复性是否要那么严格
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我做的GST融合蛋白表达也是自己摸索
先是在IPTG诱导下有无表达，然后做一个IPTG浓度梯度表达和诱导时间表达，看哪个条件好
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就我看来，复性应该是要求要蛮严格得，起码肯定比his标签要严格的多。因为我包含体溶解完浓度很大的，但是结合的很少，大多都在穿透液中。你可以按照说明书上说的改善结合条件，有一点帮助，但是我感觉还是没有质的改变，至少获得mg级的蛋白很难。
不知道其他做过的战友有什么经验没。
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不知道你的表达系统和表达条件具体是怎么样的？
如果用E.Coli体系表达，不同温度和诱导浓度会很大程度影响蛋白的可溶性，你可以先做个梯度实验摸索一下。一把来说，GST蛋白的可溶性是比较好的，大多数是可以形成胞内可溶，通过破菌可以抽提出可溶的蛋白，而不需要复性
破菌的条件也很重要，如果条件不合适，会形成蛋白断裂或降解，或者破菌不完全
纯化的条件有protocol可以查，先按照sepharose 4B的规程来做，再根据具体纯化的问题进行优化。
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GST融合蛋白通常是可以有可溶性表达的，可以尝试一下降低诱导温度。可以选择30度、33度、35度和37度分别诱导表达，诱导时间也可以调整。我知道有人用20度过夜诱导，得到了可溶性的表达。
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GST融合蛋白通常是可以有可溶性表达的，可以尝试一下降低诱导温度。可以选择30度、33度、35度和37度分别诱导表达，诱导时间也可以调整。我知道有人用20度过夜诱导，得到了可溶性的表达。
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温度很关键，如果有低温摇床的话，表达温度尽量不要超过25度}