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用反复冻融法裂解的细胞，是贴壁的还是消化下来的细胞？很多资料上都写着－20度/37度反复冻融三次，但看到过一位丁香园荣誉版主发的帖子说－80度/37度冻融一次就可以了，请问两者裂解效果有无区别哪，哪种更优？&
提问者： [] [] []
回答者： [] [] []
二级 二星助者
冻融裂解细胞是为了得到检测需要的蛋白，细胞是否贴壁都可以这么做，我们采用的是液氮反复冻融三次，要求速冻速解，减少对蛋白活性的损伤。
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生物秀旗下 [Website]请问反复冻融，融化温度是多少合适呢 - 实验交流 - 生物秀
标题: 请问反复冻融，融化温度是多少合适呢
摘要: [请问反复冻融，融化温度是多少合适呢] 我想用反复冻融法提取细菌全蛋白，融化温度是37度呢，还是室温，或者冰上？如果是37度，蛋白会降解吗？37度应该是很多酶的最适温度，需要加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)吗? 关键词:[融化 反复冻融 冻融法 细菌 蛋白酶抑制剂 最适温度 降解]……
我想用反复冻融法提取细菌全蛋白，融化温度是37度呢，还是室温，或者冰上？如果是37度，蛋白会降解吗？37度应该是很多酶的最适温度，需要加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)吗?
我们实验室融化温度都是37度，而且也都没有加酶的抑制剂，不会溶解的
我们实验室融化温度都是37度，而且也都没有加酶的抑制剂，不会溶解的
我想用反复冻融法提取细菌全蛋白，融化温度是37度呢，还是室温，或者冰上？如果是37度，蛋白会降解吗？37度应该是很多酶的最适温度，需要加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)吗?朋友你说的几种方法都可以，只是放37度解冻快些，这样对于细菌的裂解来说更好。我觉得没有必要加入蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)，因为即使是达到了最适温度，酶反应也需要一定的时间吧，你放37度，最多十分钟就完全解冻了，然后又放入低温冰箱了。即使是你放在室温或冰上，那么解冻的时间不是也延长了吗？这样如果酶会反应还是一样会反应的。不加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的原因还有就是为了后期的试验的需要，就是对蛋白的处理越少就对它的性质越好，尽量减少处理的步骤，这样对于后期的功能研究等方面都是有好处的。再说你可以加与不加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)都试一试，然后比一比再确定，个人认为没有必要。以上仅供参考。
谢谢各位。那菌体量和 裂解液的量有 比例吧。冻融以后，是不是要在室温下放置一段时间，然后离心吧。12000rpm，30min可以吗？
谢谢各位。那菌体量和 裂解液的量有 比例吧。冻融以后，是不是要在室温下放置一段时间，然后离心吧。12000rpm，30min可以吗？什么叫裂解液呢，如果我说的没错的话，好像大部分实验室在收集湿菌体后加入的都是PBS吧。加入PBS是有一定比例的，我的比例是每克湿菌体加入8ml的PBS，当然这要根据你的菌体蛋白的表达量来说的，如果表达的多就稍微多加点，如果表达的少就稍微少加点。冻融后不是直接离心的，而是应该还有一个超声裂菌的过程，无需离心即可直接用于超声。但是超声是要放冰上的，这个说的有点多于是吧，呵呵。超声后离心为了节省时间可以用16000离心15min即可。
我是想，用裂解液提取蛋白，然后跑单向和双向电泳(two-dimensional electrophoresis)的。这里没有超声仪，郁闷阿。 还有别的方法代替超声吗
我用分子克隆书上的tritonX-100的配方，液氮反复冻融，也提出蛋白了，就是电泳条带不清晰，不知什么原因，是上样量小了吗？还是别的原因？作双向的话，杂质太多了吧
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标题: 反复冻融法裂解细胞
摘要: [反复冻融法裂解细胞] 最近要做2DE，本来想用超声裂解细胞。但是怕条件弄不好超坏了。所以打算用液氮反复冻融法来裂解细胞，请问一下具体的操作是怎样的呢？另外还想问一下，如果用超声的话，都要注意那些地方？ 关键词:[裂解细胞 冻融法 液氮]……
最近要做2DE，本来想用超声裂解细胞。但是怕条件弄不好超坏了。所以打算用液氮反复冻融法来裂解细胞，请问一下具体的操作是怎样的呢？另外还想问一下，如果用超声的话，都要注意那些地方？
首先，根据你的目的，是找新点还是观察预知蛋白，若需求的蛋白表达很低，就需要比较完全的细胞裂解法，一般方法不能满足要求的。 其次，冻溶细胞一般要求速冻速溶，－80°15分钟，液氮更快，取出迅速放入水浴37°，五分钟即可完全融化。反复三次，中间最好振荡混匀。我们的做法你可借鉴一下：先用裂解液室温裂解一小时，然后反复冻溶三次。一般可以裂解到8ug/ul。注意裂细胞时不要加太多裂解液。
多谢多谢！
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【求助】反复冻融裂解细胞
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这个帖子发布于7年零176天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教各位前辈有没有人用反复冻融的方法裂解细胞，有什么特殊要求没有？谢谢！
不知道邀请谁？试试他们
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关于丁香园如何用冻融法裂解细胞？ - 实验交流 - 生物秀
标题: 如何用冻融法裂解细胞？
摘要: 如何用冻融法裂解细胞？请教如何用冻融法裂解细胞？（体外培养的肿瘤细胞系）具体步骤是什么？即温度多少，冻几次，每次冻多长时间，融解多长时间？如何判断是否已经裂解完全？谢谢！ 关键词:[细胞 体外培养 细胞系 肿瘤]……
请教如何用冻融法裂解细胞？（体外培养的肿瘤细胞系）
具体步骤是什么？
即温度多少，冻几次，每次冻多长时间，融解多长时间？如何判断是否已经裂解完全？
用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻回复:
请问这种反复冻融法得到的细胞蛋白能否用于做western blotting?同裂解液法获得的蛋白又有何区别？
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