RT-PCR中内参蛋白GAPDH和b-actin在人和动物细胞中扩增可以用同一对引物吗?正在做RT-PCR实验,所用细胞系有人肿瘤细胞和小鼠巨噬细胞,请问所用内参蛋白GAPDH和b-actin在这两种细胞系中可以用同一对引物吗?
dfvgtyj00FB8
要回答这个问题必须看你引物的序列.你贴出来我帮你查一下,你自己也可以BLAST一下.如果在人和鼠的基因中都可以BLAST到,则可以用,否则就不可以.虽然这些House Keeper基因的同源性很高,如果引物不在同源区,还是没办法混用的.
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通常来说是不可以的.可以去查查看你够入引物那见公司所制做的引物可不可以同用在人和小鼠上.
你可以blast一下，如果同源的化有可能出条带，但产物的大小应该不一样，最好不用同一个，不然文章也没说服力。
扫描下载二维码40KD的蛋白western怎么与内参分开 - 实验交流 - 生物秀
标题: 40KD的蛋白western怎么与内参分开
摘要: [40KD的蛋白western怎么与内参分开] 我现在遇到一个问题，我的目的蛋白是40KD，但是内参：β－actin的内参是42KD,GADPH是36KD,如果一起跑的话，刚好都在maker两条带的之间，很难分开，不知道有什么办法，请大家帮帮我，谢谢了 关键词:[内参 抗体 目的蛋白 目的条带 显影 敏感 分子量 丰度]……
我现在遇到一个问题，我的目的蛋白是40KD，但是内参：β－actin的内参是42KD,GADPH是36KD,如果一起跑的话，刚好都在maker两条带的之间，很难分开，不知道有什么办法，请大家帮帮我，谢谢了回复
β－actin的内参可以改为β－Tubolin分子量为55KD左右较好,我用的是博士德,效果很好
你好，谢谢哦，我想问一下，你这个大概价格是多少呢？
那就改成先杂一个后杂一个~
我觉得楼主最好还是看看老外用什么内参为好，否则做出了东西投稿人家不承认就麻烦了。
那就改成先杂一个后杂一个~
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请具体说一下可以吗？谢谢了
常用的内参有b-actin，GAPDH。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。在WESTERN中，分子量为36kDa左右。
近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)， 而不是Actin，才是在不同的组织细胞中普遍等量表达的蛋白， 因而逐渐取代Actin， 被广泛应用于Western Blotting，作为equal loading control (等量蛋白上样内参)，β－Tubolin分子量为55KD左右。
所以建议使用这两种内参看看！祝实验顺利！
我来帮个忙，先杂你的目的条带或者内参，建议先杂内参（除非急于得到结果），一来可以看看电泳和转膜的情况，二来可以看看内参的量，常规二抗-曝光-显影之后，用抗体剥离液将杂在膜上的抗体去除，重新杂目的蛋白，之后再曝光显影，最后将两者叠加起来即可。这样可以避免你说的情况。
如果你的蛋白本来丰度较低，还是建议先杂目的条带，因为第二次杂的肯定没有第一次敏感。
谢谢各位战友，我这个目的蛋白跟GADPH跑开了呵呵，嘿嘿
我来帮个忙，先杂你的目的条带或者内参，建议先杂内参（除非急于得到结果），一来可以看看电泳和转膜的情况，二来可以看看内参的量，常规二抗-曝光-显影之后，用抗体剥离液将杂在膜上的抗体去除，重新杂目的蛋白，之后再曝光显影，最后将两者叠加起来即可。这样可以避免你说的情况。
如果你的蛋白本来丰度较低，还是建议先杂目的条带，因为第二次杂的肯定没有第一次敏感。
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请问 抗体剥离夜是何物，如何配置？
呵呵,也可以分开跑!
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【求助】内参GAPDH和β-actin趋势不同是什么原因？
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这个帖子发布于2年零109天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
提完组织蛋白后，根据所测蛋白浓度调整上样体积，上样相同蛋白量，结果GAPDH条带比较整齐一致，各组条带大小密度较一致；但是做出的β-actin条带就不一致。重复过几次，GAPDH一直比较好，β-actin总是参差不齐。请问大家有么有碰到类似的情况？到底该不该根据β-actin条带再次调整上样体积呢？为什么GAPDH和β-actin趋势不同呢？
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自己顶啊。
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我也发现这个问题了。
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核内参PCNA抗体-用于细胞核内参的PCNA单抗增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA）由Miyachi等于1978年在 SLE（系统性红斑狼疮）患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名。PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶的辅助蛋白。由于其在细胞核内稳定表达，因此其抗体被广泛应用于细胞核蛋白的内参抗体。如何选择合适的细胞核内参抗体？常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H），或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。另外，我们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。PCNA的检测分子量大约在28kD，而Histone H3的检测条带大约在18kD，因此PCNA比较适合用于检测目标蛋白在较大的WB实验，而Histone H3则不适合用于13kD-23kD大小的目的蛋白内参。另外，虽然PCNA是最合适的核内参抗体之一，但是在某些条件下，一些影响增殖的因素会导致样品间PCNA含量的变化，就不适合作为内参。β-Actin抗体推荐—高效价的Beta-Actin内参抗体Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。如何选择合适的β-Actin抗体？内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，我们需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于β-Actin的检测分子量大约在42kD，因此该内参抗体不是很适合 用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，虽然β-Actin是最合适的内参抗体之一，但是在某些条件下，一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化。特别需要注意的是，在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。很耐用，质量也很稳定，购买后放了一年了，拿出来用效价还是很高，后来买了他们大包装的，直接定制的5ml，很推荐。——北京工业大学生命科学与生物工程学院一客户另外，我们还需要考虑自己的需要，特别是实验应用上的需要。一般来说，应用类型越多，在使用过程中的选择余地就越大，而小鼠源的单克隆抗体一般在特 异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外，抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面，也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl β-Actin抗体（假如其WB检测的稀释比率是1:5000，最终使用液相当于500ml），要比效价低的1ml的β-Actin抗体（假如 WB检测的稀释比率是 1:200，最终使用液相当于2ml）性价比更高。因此在选择抗体的时候，不但需要考虑抗体的量，还需要考虑抗体的效价，即不同应用的建议稀释比率。详细地址： 如有兴趣和需要请致电免费客户专线400-到**捷科技有限公司垂询相关的产品信息及完整实验解决方案。
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