教职成司函【号&|荧光环介导逆转录等温扩增 RT-LAMP_图文_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
荧光环介导逆转录等温扩增 RT-LAMP
上传于||暂无简介
阅读已结束，如果下载本文需要使用5下载券
想免费下载本文？
下载文档到电脑，查找使用更方便
还剩1页未读，继续阅读
你可能喜欢相关行业：
关键词：　　可视化LAMP快速检测猪伪狂犬病毒　　王树芬&王德国&薛白&李学伍&赵东&张改平　　河南科技大学动物科技学院；　　河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室/河南省动物免疫学重点实验室；　　许昌学院食品科学与工程学院　　伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的危害家畜以及多种野生动物的一种以发热、奇痒（除猪外）和急性脑脊髓炎等为典型神经症状的急性传染病。伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科，基因组为线状双股DNA。猪是该病的传染源以及自然贮存宿主。该病呈现典型的潜伏感染，任何年龄的猪耐过后，均能导致潜伏感染，某些条件下潜伏的病毒可以被激活，引起复发性感染并向外散毒。该病分布广泛，据报道，目前已有40多个国家和地区发生过该病，我国已有20多个省（市）出现该病的流行，给养猪业造成了严重的经济损失。因此，对准确而快速地诊断该病显得尤为重要。　　目前对该病的常用检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）等。这些方法存在操作繁杂、费时等缺点，如PCR虽然特异性较强，但需要昂贵的仪器，一般需要2h~3h来完成。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是一种可对核酸进行高效扩增并广泛应用于疫病快速检测的新型检测方法，由日本学者Notomi等发明。LAMP是在具有链置换活性的BstDNA聚合酶作用下，利用能识别目的基因上6个独立区段的4条引物，即正向内侧引物（forwardinnerprimer，FIP）、正向外侧引物（forwardouterprimer，F3）、反向内侧引物（backwardinnerprimer，BIP）、反向外侧引物（backwardinnerprimer，B3），在60℃~65℃等温条件下高效特异地扩增目的基因。2002年，Nagamine等在此基础上添加了2条环状引物，上游环状引物（LF）和下游环状引物（LB），环引物的增加提高了反应速度，缩短了反应时间。LAMP法是新型的基因扩增法，具有以下特点：快速（30min~60min）、简便、敏感、特异、不需要昂贵的仪器设备，仅水浴锅就可以检测，适合现场使用，能在短时间内获得结果。LAMP技术目前已经应用于多种病毒的检测。　　环介导等温扩增技术虽然简便、灵敏，但是扩增产物的检测是限制该技术推广应用的技术瓶颈。鉴于此，本研究采用罗丹明B衍生物做指示剂（将其加在反应缓冲液里），用猪伪狂犬病毒保守特异的DBP（DNA结合蛋白）基因上的一段序列设计一套引物，建立染料与LAMP体系结合的检测体系，旨在对猪伪狂犬病毒的快速检测提供支持。　　1材料和方法　　1.1病毒株及病料　　猪伪狂犬Bartha株细胞毒由河南省动物免疫学重点实验室保存；临床病料脾脏采集自河南某猪场。　　1.2主要试剂和仪器　　10×Thermopol反应缓冲液、BstDNA聚合酶购自NEB公司；MgSO4购自Sigma公司；DS2000DNAMarker购自广州东盛生物科技有限公司；dNTPMixture购自Takara公司；罗丹明B衍生物荧光指示剂由许昌学院王德国博士惠赠；HHD-2恒温水浴锅购自上海比郎有限公司；ZS220型凝胶成像仪购自美国基因工程公司；PTC200型梯度PCR仪购自美国基因工程公司。　　1.3引物的设计与合成　　依据GenBank中DBP基因上的一段保守序列，利用PrimerExplorerV3软件（http://primerexplorer.jp/e/）设计LAMP引物，包括2条外引物F3、B3，2条内引物FIP、BIP和2条环引物LF、LB。PCR引物为PRVgp50基因的一对引物，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。　　1.4核酸DNA的提取　　取三冻三融后的细胞毒液200μL，12000r/min离心10min；取上清，加入等体积的细胞裂解液，加入5μL蛋白酶K混匀，56℃水浴2h；加入等体积饱和酚，12000r/min离心5min；取上清，加入等体积饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）12000r/min离心5min；取上清，加入等体积氯仿，12000r/min离心5min；取上清，加入1/10体积的醋酸钠，2.5倍体积的预冷无水乙醇；常温静置2h，12000r/min离心20min，弃上清；加入75%的乙醇混匀，12000r/min离心10min，弃上清；待风干后溶解于20μL无菌去离子水中，-20℃条件下保存备用。　　1.5PRVLAMP检测方法体系的建立　　参照相关文献，确立LAMP反应体系为25μL：10×Thermopol反应缓冲液2.5μL，dNTP（10mmol/L）2.0μL，Mg2+（50mmol/L）1.5μL，混合引物（FIP、BIP：40μmol/L；F3、B3：20μmol/L；LF、LB：5μmol/L；将稀释好的引物等量混合）6.0μL，BstDNA聚合酶（8U）1.0μL，模板DNA2.0μL，加灭菌双蒸水10.0μL。在63℃水浴锅内扩增40min，取5μL反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　1.6可视化LAMP体系的优化与建立　　将罗丹明B衍生物荧光染料加到10×Thermopol反应缓冲液里，配成一定浓度的缓冲液，所用的指示剂与dNTP、Mg2+有关。在上述25μL体系的基础上，根据指示剂的颜色调整dNTP、Mg2+的量，使反应前为紫色，反应后成蓝色，最终确定可视化LAMP体系为：10×Thermopol反应缓冲液2.5μL，dNTP（10mmol/L）2.5μL，Mg2+（50mmol/L）2.0μL，混合引物6.0μL，BstDNA聚合酶（8U）1.0μL，模板DNA2.0μL，加灭菌双蒸水9.0μL，总体积为25μL。　　反应温度分别用59、61、63、65℃，确定最佳温度。反应时间用25、30、35、40、45、50min，进行优化。用肉眼观察颜色变化来进行温度和时间的优化。　　1.7临床样品的检测　　取PCRPRV阳性临床样品12份，将适量组织病料剪碎后，转移置无菌离心管内，加入1mLPBS，盖紧，用组织匀浆机研磨制成悬液。按照1.4的步骤提取DNA。用优化好的LAMP体系检测，对比两种方法的符合率。　　2结果与分析　　2.1LAMP反应体系的建立　　建立的LAMP体系在63℃水浴锅内扩增40min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。阴性用灭菌双蒸水作模板无梯形条带，阳性用细胞毒提取的DNA作模板出现了LAMP特征性的梯形条带。　　2.2可视化LAMP反应结果　　按照建立的可视化LAMP体系，优化后得出：在63℃恒温反应40min时，得出最佳效果，可以明显地区分出阳性跟阴性对照（图2），阴性对照为紫色，阳性为蓝色。可视化LAMP反应后，扩增产物作1%琼脂糖凝胶电泳鉴定（图3），阴性无条带，阳性出现LAMP的特征性条带，可视性LAMP反应的电泳图与不加指示剂的电泳图一致，说明本试验选择的指示剂效果较好，并且建立的可视化LAMP体系可以检测猪伪狂犬病毒。　　2.3临床样品的检测结果　　设计的PCR引物目的片段大小为217bp，12份阳性样品的PCR结果见图4。可视化LAMP检测的12份临床阳性病料显示蓝色则为阳性。对获得的12份临床阳性样品的可视化LAMP检测得到的结果与PCR结果一致（表2），说明建立的可视化LAMP方法可以用于临床检测。　　3结论与讨论　　猪伪狂犬病是严重危害养猪业健康发展的主要传染病，对该病的检测是控制和净化该病的重要手段之一。杨睿、张莉等已经分别根据伪狂犬gE基因的保守序列建立了快速诊断伪狂犬病毒的LAMP方法，他们应用的均是SYBRGreenⅠ染料。根据设计引物的保守、特异的原则，本研究选用PRV的DBP基因上的一段序列设计LAMP引物，采用一种新的荧光染料——罗丹明B衍生物作指示剂，并与LAMP体系结合，建立了可视化LAMP快速检测猪伪狂犬病毒。　　LAMP技术有简单、快速、准确等特点，但容易污染，扩增产物的检测受到限制。目前扩增结果的判定方法有电泳法和浊度法。但电泳法容易造成气溶胶污染，且需要用到对人体有害的溴化乙锭（EB）；而浊度法肉眼观察浊度容易受到主观因素的影响，浊度仪价格昂贵。前人的研究中常用SYBRGreenⅠ染料，反应前加入会抑制反应，反应后加入需要开盖，会造成污染。本研究中应用的罗丹明B衍生物指示剂直接加在反应缓冲液里，反应后可直接判定结果，不需要开盖，减少了污染的机会，且结果判定简单、准确。在LAMP反应前加入不抑制反应的指示剂的研究将有很好的发展空间，可视化LAMP的快速检测在诊断动物疾病上有广阔的应用前景，适合在基层养殖场应用。(审核编辑: 猪猪侠)分享我来说两句（人参与评论）加载更多【销售】长年供18月8日评：立秋消费带动 国内猪价14232业内人士：生猪价格不会继续跌下去了71038.8日屠宰日评：立秋结束需求回落6864谈谈未来生猪养殖业的发展趋势6505业内：猪价没有理由暴跌 但乐观空间5916.瘦肉型肉猪(115687养殖户：一味追求猪价的制高点只能加4558农业部发布口蹄疫、高致病性禽流感疫4399高价补栏仔猪面临成本风险42710短期内终端消费难以恢复 猪价大幅上399The page is temporarily unavailable
nginx error!
The page you are looking for is temporarily unavailable.
Please try again later.
Website Administrator
Something has triggered an error on your
This is the default error page for
nginx that is distributed with
It is located
/usr/share/nginx/html/50x.html
You should customize this error page for your own
site or edit the error_page directive in
the nginx configuration file
/etc/nginx/nginx.conf.}