工业酒精酵母甘油途径的代谢工程改造--《江南大学》2014年硕士论文
工业酒精酵母甘油途径的代谢工程改造
【摘要】：随着化石能源的日益消耗及其不可再生性，乙醇作为可替代化石燃料的可再生清洁能源，备受人们关注，其产生的社会意义影响深远。厌氧条件下，酿酒酵母生产乙醇的过程中，甘油是主要的副产物。其中，大约4~10%的碳源用于甘油的生产，如果能将流向这部分甘油的碳源用于乙醇的生产，将会带来巨大的社会和经济效益。本课题运用分子生物学手段，对工业酒精酵母的甘油代谢途径进行基因改造，主要从甘油合成，甘油分解以及辅酶代谢三个方面入手，以期构建新型的工业酒精酵母重组菌株，使得工业酒精酵母在不影响其生长速率的前提下，降低甘油的产量进而提高乙醇的产量。
(1)甘油分解途径主要是将甘油分解为磷酸二羟基丙酮，其中包含由GCY1或YPR1基因编码的甘油脱氢酶和DAK1或DAK2编码的二羟丙酮激酶。在工业酒精酵母中加强表达甘油分解的关键酶基因GCY1和DAK1，得到重组单倍体菌株S.cerevisiae GDA1、GDA2，以及重组杂合菌株S.cerevisiae GDA。S.cerevisiae GDA1、GDA2乙醇得率分别提高了3.19%，2.82%，甘油得率分别降低了19.24%，18.63%，而重组杂合菌S.cerevisiaeGDA乙醇得率提高了3.93%，甘油得率降低了20.54%，但是胞内的NADH浓度为77.2μmol L-1，明显高于野生菌的40.8μmol L-1。
(2)甘油合成途径的关键酶基因是编码NAD+依赖型3-磷酸甘油脱氢酶的GPD2，POS5编码的NADH激酶可以在ATP的存在下将NADH转化为NADPH。在工业酒精酵母中敲除甘油合成关键酶基因GPD2的同时过表达辅酶基因POS5，构建了一个敲除突变盒gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR，分别转入工业酒精酵母单倍体菌株α和a，并杂交得到重组菌S.cerevisiae PA，其最大比生长速率与野生菌较为相近，解决了由于只敲除GPD2引起的菌株最大比生长速率明显降低的问题。S.cerevisiae PA乙醇得率较原始菌提高了7.47%，甘油得率降低了35.27%，同时缓解了胞内的高浓度NADH。
(3)基于(1)、(2)，在(1)中得到的重组单倍体菌株S.cerevisiae GDA1和GDA2的基础上，分别转入敲除突变盒gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR，将甘油合成途径，甘油分解途径和辅酶代谢途径的改造同时应用在酵母中，最终获得重组杂合菌S.cerevisiae PGDA，其乙醇得率提高了8.38%，甘油得率降低了48.96%，胞内的NADH浓度比原始菌略高。
(4) FPS1编码甘油通道蛋白，主要调控甘油的渗出。在工业酒精酵母中，敲除甘油通道蛋白基因FPS1，得到重组菌S.cerevisiae FA，其生长速率受到抑制，乙醇得率提高了4.08%，甘油得率降低了20.98%；将游离表达载体pYX212-POS5-Kanr转入重组菌S.cerevisiae FA，即得到重组菌S.cerevisiae PFA，其生长速率高于S.cerevisiae FA，且乙醇得率提高了5.79%，甘油得率降低了29.46%，并有效降低了胞内的NADH含量。
【关键词】：
【学位授予单位】：江南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：TQ223.122【目录】：
摘要3-4Abstract4-9第一章 绪论9-17 1.1 燃料乙醇的概述9-10
1.1.1 乙醇的简介9
1.1.2 燃料乙醇的发展意义9
1.1.3 燃料乙醇的发展现状9-10 1.2 甘油途径代谢工程10-13
1.2.1 甘油途径的概述10-12
1.2.2 甘油途径改造的研究进展12-13 1.3 辅酶代谢工程13-15
1.3.1 辅酶代谢的概述13-14
1.3.2 辅酶代谢途径改造的研究进展14-15 1.4 课题的研究意义15-16 1.5 课题的主要研究内容16-17第二章 材料与方法17-27 2.1 实验材料17-20
2.1.1 菌株与质粒17-18
2.1.2 引物18-19
2.1.3 试剂和试剂盒19
2.1.4 培养基和培养条件19
2.1.5 主要仪器和设备19-20 2.2 实验方法20-27
2.2.1 工业酒精酵母染色体的提取20
2.2.2 大肠杆菌(E.coli JM109)感受态细胞的制备及转化20-21
2.2.3 工业酒精酵母的醋酸锂转化21-22
2.2.4 常规分子生物学操作22
2.2.5 目的基因的 PCR 扩增22-23
2.2.6 敲除 GPD2 基因同时过表达 POS5 基因载体的构建23
2.2.7 敲除 FPS1 突变盒的构建23
2.2.8 游离表达载体 pYX212-POS5-Kan~r的构建23
2.2.9 酿酒酵母单倍体的杂交23
2.2.10 重组菌 S.cerevisiae GDA1、GDA2、GDA 的构建23-24
2.2.11 重组菌 S.cerevisiae PA1、PA2、PA 的构建24
2.2.12 重组菌 S.cerevisiae PGDA1、PGDA2、PGDA 的构建24
2.2.13 重组菌 S.cerevisiae FA1、FA1、FA 的构建24
2.2.14 甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶酶活的测定24-25
2.2.15 NADH 激酶酶活的测定25
2.2.16 乙醇的发酵工艺25
2.2.17 胞内 NADH 浓度的测定25-26
2.2.18 发酵产物的分析测定26-27第三章 结果与讨论27-48 3.1 甘油分解途径在工业酒精酵母中的加强表达27-32
3.1.1 重组菌 S.cerevisiae GDA1、GDA2、GDA 的验证27-28
3.1.2 重组菌 S.cerevisiae GDA1、GDA2 和 GDA 甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶酶活的测定28
3.1.3 重组菌 S.cerevisiae GDA1、GDA2、GDA 发酵性能的研究28-31
3.1.4 重组菌 S.cerevisiae GDA1、GDA2、GDA 与原始菌胞内 NADH 含量的比较31-32 3.2 甘油合成途径和辅酶代谢途径对工业酒精酵母的调控32-37
3.2.1 敲除 GPD2 同时过表达 POS5 基因载体的构建32-34
3.2.2 重组菌 S.cerevisiae PA1、PA2、PA 的验证34-35
3.2.3 重组菌 S.cerevisiae PA1、PA、PA NADH 激酶酶活的测定35
3.2.4 重组菌 S.cerevisiae PA 与原始菌 S.cerevisiae 发酵性能的研究35-36
3.2.5 重组菌 S.cerevisiae PA 与原始菌 S.cerevisiae 胞内 NADH 含量的测定36-37 3.3 甘油分解途径、甘油合成途径和辅酶代谢途径对工业酒精酵母的共同调控37-41
3.3.1 重组菌 S.cerevisiae PGDA1、PGDA2、PGDA 的验证37
3.3.2 重组菌 S.cerevisiae PGDA1、PGDA2、PGDA NADH 激酶酶活的测定37
3.3.3 重组菌 S.cerevisiae PGDA 与原始菌 S.cerevisiae 发酵性能的研究37-38
3.3.4 重组菌 S.cerevisiae PGDA 与原始菌 S.cerevisiae 胞内 NADH 含量的测定38
3.3.5 综合四株重组菌与原始菌的发酵性能的比较38-40
3.3.6 综合四株重组菌与原始菌胞内 NADH 含量的比较40-41
3.3.7 小结41 3.4 验证敲除甘油通道蛋白基因 FPS1 对工业酒精酵母的影响41-48
3.4.1 敲除 FPS1 基因敲除突变盒的构建41-42
3.4.2 重组菌 S.cerevisiae FA1、FA2、FA 的验证42-43
3.4.3 游离表达载体 pYX212-POS5-Kanr的构建43-44
3.4.4 重组菌 S.cerevisiae PFA 的验证44
3.4.5 重组菌 S.cerevisiae PFA NADH 激酶酶活的测定44-45
3.4.6 重组菌 S. cerevisiae FA、PFA 与原始菌发酵性能的比较45-47
3.4.7 重组菌 S. cerevisiae FA、PFA 与原始菌胞内 NADH 含量的测定47-48主要结论与展望48-50致谢50-51参考文献51-55附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文55
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世界那么大，却又那么远；有没有一个地方，既有法国的浪漫，又有西班牙的狂热；既有瑞士的奇幻，又有新西兰的田园；Eurail pass通常被称为"欧洲火车联票"，是给在欧洲多次乘火车的游客设计的一种车票，可以在限定的国家贵州的黔东南地区聚居了太多少数民族，凭借着奇美的山川、绚丽的风光和丰富多彩的民族文化吸引了众多游客，看形态各你相信世界上真的有伊甸园吗？看完迪拜那间七星级的帆船酒店，似乎不得不相信了。去年一篇去迪拜捡垃圾的文章席卷朋如果世界上有一件事情可以让女人超越对物质、对男神的喜欢，可以让男人抵御美女、游戏的诱惑，那一定是自驾！没有一把山川日月穿上身体会来自自然的魅力云朵晚霞火烧云雷电波浪紫藤枫叶沟壑海底沙丘极光外出旅行，怎么能少了拍美照呢。很多人辛辛苦苦拍了半天照片，动作只有剪刀手，一看就是游客照。不要捉急，小编现在倚天屠龙记1武当山武当山位于湖北省北部十堰市境内，山势雄伟，面临丹江口水库，背依神农架林区。道教建筑遍及全山旅行是什么，或者什么才叫旅行，比如到了普者黑。欣赏这里独特的喀斯特山水田园风光，看看天鹅，走走湿地，乘坐人力海的外面是什么？是自由。年轻时激昂，想改变世界，想要自由，想要买买买，想要迎娶白富美走上人生巅峰……但想要的天气即将转入六月，躺在沙滩上，海风迎面扑来，安静地享受阳光的火热和西瓜的冰凉，仿佛是每个夏天的梦想。在这些海她95岁，是一名时尚圈红人！她的日常生活是买衣服，看秀，拍杂志。时尚一直都无关乎年龄，爱美之心也是一样的她叫到了泰国才知道，美女裤裆里有小鸟到了日本才知道，死不认账的人也会讲礼貌到了韩国才知道，美女不是父母的创造到了若你寻求和平宁静、悠然自得，那么这里就是梦想中的天堂。若你追求刺激、喜欢冒险，这里也具有无可抗拒的吸引力。有★上天会奖赏那些走过风雨的人★你以为这是家里熊孩子的随手乱画？错，这是他们一家三口的旅行路线Mihai Ba当你明天在缠绵之后与爱人道别说“再见”的时候，意味着你们很快就会再次见面。今天给大家推荐的这组老照片拍摄于战西藏、多少人心中的圣地这片千山之巅、万水之源的土地这里对信仰的虔诚好比爱情一路颠簸、空气稀薄但却无限美好、圣关于旅途拍照技巧，把这些带到路上边看边学边拍，刷爆你的朋友圈吧！海岛必备秋天不止看黄叶，其实还可以去温暖的海这世间有许多高跟鞋走不了的路有许多坐在办公室看不见的风景如果你拒绝旅行是因为金钱的匮乏那么这些地方将是你开启在热烈的夏天，有什么比一头扎进水里更畅爽的呢？！有一个地方，靠水就征服了全世界！能满足你对夏日、海岛、热情、前段时间，《国土安全》女主Claire Danes身着这条夜光裙出息今年的Met Gala惊艳了世界，这条会34岁的Liz Clark，原本是美国一名调酒师。十年前她突然决定放弃工作，完成自己的人生梦想：环海旅行，走迪拜在很多人的印象中土豪是诠释它的最好代名词可事实上你觉得亚洲最土豪的国家真的没有那么豪可能连它的十分之一都每当打开中国地图，你可曾对一条线产生过好奇？它跨过山地、高原、草原、沙漠、平原，穿越几十个少数民族的聚居地，夏天即将来临，小编也想要一个这样的海岛，尽情畅游↓↓↓这是一个，只是听到名字就会爱上的地方这是一个，现实世界摄影的乐趣，在于经常有意外的收获，这不，下面这组野生动物摄影师和动物的合影，会令你一见难忘的！舔舔毛我想问摄春天的余额显然已经不足啦，接下来就是迎接夏季的时候了，夏季是万物疯狂生长的季节，世界的一切，都像是正值青春的走很多路比起去到哪都在路上拦计程车，用自己的双脚漫步在街道上更能感受城市氛围，因为从容才有机会撞见不同的人、一到节假日，朋友圈环球摄影大赛就要开幕，当旅行最终变成了打卡拍照，发朋友圈的指定套路……那旅行的意义到底是什不知不觉，时间已经走到了五月中旬，在这个春夏交织的完美季节中，旅行如渐穿渐少的服饰一样火热起来。人间最美四月摄影师 Emily Blincoe 和艺术家 Brittany Wright用食物和色彩治愈你的强迫症▼看完享受旅行的全部过程，从订票做攻略到旅程结束，这所有的过程都让人陶醉其中、乐此不疲。2当城市的繁琐让你烦躁不堪谈到旅行，有人说，旅行啊？我喜欢，等有了假期一定去；有人说，旅行啊？我喜欢啊，等我攒够了钱就去；也有人说，旅不是所有人都来过，但只要来了你就不会忘记。初夏这么妩媚的季节，这么柔美的时光，爱旅行的你，怎么能错过这些美得据说丘吉尔曾在这里悠然地点燃雪茄，放下了整个世界；贝克汉姆迎着海风，包下酒店纪念他和贝嫂的结婚十周年；威廉王工作要有进取心，休闲要有调皮劲儿。倪妮这姑娘像初夏一股清新的凉风，迎面扑来，让人不得不爱。你们都在关注倪妮的如果每一次旅行都当作一次猎奇，你会发现，虽然游走的每一座城市都有古怪的东西，但是总有一些新奇到让你觉得大自然其实人人都想要来一场说走就走的旅行，在钢筋水泥中待的时间长了谁不想出去呼吸一下带着青草的空气、吹一吹咸咸的海曾因为一本地理杂志吸引，三毛背着行囊走进了荒凉单调的撒哈拉沙漠，在沙漠的贫瘠中感受生活的富饶，流浪在远方。很趁时光美好，和亲爱的TA一起去旅行吧！法国：巴黎这个灯光之城也是爱情之城。和她一起塞纳河畔挽手，小酒馆烛光晚有时候，一张照片能传达的讯息远胜过整个历史事件！在这个纷乱的世界上，人性尤其不断地在各种最好与最坏的情况下被不同的季节总是有不同的风情在对的时间去对的地方才不枉人间最美的风景你知道五月哪里才最美吗？云南中甸--香格里素材来源于网络，若有侵权，请联系删除，谢谢！每次旅行一定会去看看当地的标志性建筑。全球50个地标性建筑，看看它们，是摄影爱好者的天堂，每一个，都能点燃你澎湃的创作欲望。看看你，到底去过几个1福建霞浦霞浦县，福建省宁德这些孩子纯净的眼神，一不小心就跌进去。旅行的过程，是一个自然而然地磨练性格、培养技能的过程，既有启发性，又富于教育性。经常旅行的人在旅途中学会了这如果我看过你曾看过的风景，走过你曾走过的路，是不是就可以离你更近一点？也许再多的甜言蜜语也抵不过相伴到底，我长滩岛，菲律宾中部的阿尔坎省SULU海中的一个小岛。说它是小岛一点都不为过，因为它长度只有7公里宽4公里。长野生动物的照片为什么那么稀奇，因为它们非常难得！想要拍摄到一张满意的野生动物照，一般情况下，你除了耐心等待，Joe Greer在INS放了一张红发美女的背影图，并附文“我和她结婚的59天”刚刚发布就上了当天热门。这女huanqiu-travel你不走出去，以为这就是世界！热门文章最新文章huanqiu-travel你不走出去，以为这就是世界！}