Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) | Protocol (Translated to Turkish)
Automatic Translation
This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate. |
&JoVE Developmental Biology
Foto?evrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma bal??? Embriyolar protein stabilitesi ?l?ümü (FDAP)
1, 2, 1, 2
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society
Enter your email to receive a free trial:
Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!
Hücre ve dokularda protein seviyeleri, ?o?u zaman s?k? bir ?ekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Foto?evrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kineti?i deneysel in vivo olarak ?l?ülebilir.
Date Published: 1/28/2015, ; doi:
Keywords: , , , , , , , , ,
Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP). J. Vis. Exp. (95), e52266, doi:10. (2015).
Protein istikrar biyoloji bir?ok a??dan etkiler ve proteinlerin temizlenmesi kinetik ?l?üm biyolojik sistemlere ?nemli bilgiler sa?layabilir. FDAP deneylerde, canl? organizmalar i?inde protein a??kl?k ?l?ülebilir. ?lgi dahilindeki bir proteini, photoconvertible floresan protein with in vivo ifade photoconverted ve zaman i?inde photoconverted sinyal azalmas? takip edilir. Veriler daha sonra, protein yar? ?mrünü tayin etmek i?in uygun bir a??kl?k modeli ile donat?lm??t?r. ?nemlisi, organizman?n farkl? b?lümlerinde protein popülasyonlar?n?n a??kl?k kineti?i b?lmeli maskeleri uygulayarak ayr? ayr? muayene edilebilir. Bu yakla??m, zebra bal??? geli?imi esnas?nda salg?lanan sinyal proteinleri ve hücre i?i ve hücre d??? yar?lanma ?mürlerine belirlemek i?in kullan?lm??t?r. Burada, biz Zebra bal??? embriyolar FDAP deneyler i?in bir protokol a??klar. Bu klirensi kinetiklerini belirlemek i?in FDAP kullanmak mümkün olmal?d?rherhangi bir optik olarak eri?ilebilir bir organizmada bir taggable proteini.
hücre ve organizmalardaki protein seviyeleri, üretim ve klirens oranlar?na g?re belirlenmektedir. Protein yar? ?mürleri dakika gün 1-4 aral???nda olabilir. Bir?ok biyolojik sistemlerde, anahtar proteinlerin stabilizasyonu veya a??kl?k hücresel aktivite üzerinde ?nemli etkileri vard?r. Hücre i?i protein stabilitesi modülasyonu, hücre d?ngüsü ilerlemesinin 5,6, geli?im sinyal 7-9 apoptoz 10 ve normal fonksiyon ve n?ronlar?n 11,12 ettirilmesi i?in gereklidir. Hücre d??? protein kararl?l??? bir doku i?inde da??l?m? ve morphogens 13,14 olarak salg?lanan proteinler, kullan?labilirli?ini etkiler.
Son birka? y?ld?r, protein stabilitesi esas radyoaktif darbe-etiketleme ya da sikloheksimid kovalamaca deneyleri 15 kullan?larak hücre kültüründe de?erlendirilmi?tir. B?yle darbe kovalay?c? deneyler, hücreler ya da ge?ici olarak bir radyoaktif amino &darbe& maruzasit ?n-maddeleri, yeni sentezlenmi? olan proteinlerle birle?tirilmi?tir, ya da protein sentezini inhibe sikloheksimid, maruz kald???. Kültürlenmi? hücreler, daha sonra farkl? zaman noktalar?nda toplan?r, ve ya (radyoaktif darbe kovalay?c? deneyler) otoradyografi ile takip immüno ya da (sikloheksimid deneylerinde) bat? beneklemesinden zaman i?inde protein a??kl?k ?l?mek i?in kullan?l?r.
Konvansiyonel protein stabilitesi deneyleri baz? eksiklikleri vard?r. ?lk olarak, bu deneylerde proteinler genellikle endojen ortamlarda ifade edilmez, bunun yerine farkl? türlerden elde edilen hücreler, doku kültürü i?inde, bazen de. Stabiliteleri ba?lam-ba??ml? proteinleri i?in, bu yakla??m sorunludur. ?kinci olarak, zaman i?inde tek tek hücreler ya da organizmalar protein a??kl?k takip etmek mümkün de?ildir, ve bu deneylerde elde edilen veriler, farkl? zaman noktalar?nda farkl? hücre popülasyonlar?n?n ortalamas?d?r. Tek tek hücreler ba?lam?? olabilir bu yanaproteinin farkl? miktarlarda farkl? zamanlarda radyoaktif etiket ya da sikloheksimid alm?? olabilir, ya da farkl? a??kl?k kineti?i, ?rne?in toplam veri yan?lt?c? olabilecek olabilir. Son olarak, sikloheksimid takip deneylerinde durumunda, protein sentez ?nleyicisi ilave yapay protein kararl?l???n?n 16-18 de?i?tirebilir istenmeyen fizyolojik etkilere sahip olabilir. Bu eksiklikler, Foto?evrim (FDAP) sonra photoconvertible proteinler Organizma 19-25 canl? dinamik proteini a??kl???n? ?l?mek i?in kullanan bir teknik Floresan Bozunma kullan?larak ?nlenebilir (FDAP teknik s?n?rlamalar? i?in b?lümüne bak?n?z).
Photoconvertible proteinler olan uyarma ve emisyon ?zellikleri hafif 26 ?zel dalga boylar?na maruz kald?ktan sonra de?i?tirmek floresan proteinleri vard?r. Genel olarak kullan?lan bir varyant Dendra2 ba?lang??ta eski bir &ye?il i?in k?rm?z?& photoconvertible proteindirat?f ve emisyon ye?il floresan protein benzer ?zellikler, fakat UV ???k &Foto?evrim& maruz kald?ktan sonra uyarma-onun / emisyon ?zellikleri k?rm?z? flüoresan protein 23,27 benzer hale gelir. Daha da ?nemlisi, Foto?evrim sonra üretilen yeni bir protein photoconverted proteinin sadece bir havuz Foto?evrim üzerine üretimi ve temizlenmesi ayr?lmas?na ve g?zlem izin photoconverted protein ile ayn? uyar?m / emisyon ?zellikleri sahip olmayacakt?r. Photoconvertible proteinleri ile ilgi proteinleri Etiketleme ve b?ylece darbe-etiket i?in sa?lam, optik eri?ilebilir canl?larla proteinleri uygun bir yol sa?lar.
FDAP deneyleri (?ekil 1A) 'de, ilgi konusu bir protein photoconvertible protein ile etiketlenir ve bir canl? organizmada (?ekil 1B) olarak ifade edilmi?tir. Füzyon proteini photoconverted edilir ve zaman i?inde photoconverted sinyal azalmas? flüoresan ile izlenirce mikroskobu (?ekil 1C). Veriler daha sonra füzyon proteininin (?ekil 1D) yar? ?mrünü tayin etmek i?in uygun bir model ile donat?lm??t?r.
Burada anlat?lan FDAP tahlil erken embriyogenez 19 d?neminde Zebra bal??? embriyolar?n?n salg?lanan sinyal proteinlerin hücre d??? yar?m hayatlar?n? belirlemek i?in tasarlanm??t?r. Bununla birlikte, bu yakla??m, canl? g?rüntüleme tolere eder ve herhangi bir taggable hücre i?i ya da hücre d??? proteinin a??kl?k izlemek i?in kullan?labilecek herhangi bir ?effaf model organizma i?in adapte edilebilir. Burada tarif edilen tekni?in varyasyonlar? kültürlenmi? hücreler 20,23 ve Drosophila 22 ve fare 21 embriyo olarak yap?lm??t?r. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
1. Bir Photoconvertible Fusion Construct ve Damari?i dechorionated Zebra bal??? Embriyolar Yaratma
Daha sonra Müller ve ark., 2012, 19 olarak füzyon proteinini kodlayan ba?l?kl?
üretmek i?in, in vitro transkripsiyon kullan?n ye?ilden k?rm?z? photoconvertible protein (Tart??ma) füzyonlanan ilgi konusu bir proteini ihtiva eden bir fonksiyonel yap? olu?turur.
Tek hücre a?amas?nda yakla??k 30 zebra bal??? embriyolar?n chorions kald?rmak i?in pronase kullan?n. Se?enek olarak ise, el forseps 28 kullan?larak embriyolar dechorionate.
Not: Embriyolar daha sonra g?rüntüleme i?in dechorionated gerekir. Arzu edildi?i takdirde, embriyolar g?rüntüleme hemen ?nce, daha sonra koryon enjekte edilmi? ve dechorionated edilebilir.
Standart Zebra bal??? embriyo orta 19 Streptomyces griseus gelen Pronaz bir 5 mg / ml stok solüsyonu olun. 10 dk proteaz eritmek i?in izin i?in hafif?e oda s?cakl???nda ??züm Kaya. K?s?m 2 m,-20 ° C'de mikrosantrifüj tüplerine L ve dondurularak.
~ 8 mi embriyo orta ihtiva eden bir 5 cm ?ap?nda bir cam ya da agaroz kapl? plastik Petri taba??na aktar?n tek hücreli a?amada embriyolar. ?anak ??zülmü? Pronaz stok ??zeltisi 2 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca oda s?cakl???nda inkübe edilir.
Dechorionated embriyolar y?rt?lmas?na neden olur biriyle temas gibi, hava veya plastik embriyolar maruz b?rakmay?n. Embriyo ortam? ile 200 ml'lik bir cam beher. Orta dald?rarak ise Petri kab? e?erek beher embriyolar transfer.
Embriyolar beher alt?na yerle?mi? sonra, daha sonra beher i?ine taze embriyo orta d?kün, embriyo orta ?o?u d?kmek. beher i?ine bo?alt?larak orta hafif d?nen embriyolar zay?flam?? chorions kaybetmenize neden olur.
Ad?m? yineleyin 1.2.4.
Bir Alevli ucu bir cam Pasteur pipet kullanarak bir agaroz kapl? enjeksiyon ?anak 29 dechorionated embriyolar transfer. Yananpipet yaraland? embriyolar t?rt?kl? kenarlar? engeller.
(?ekil 1B, ?nerilen mRNA ve Alexa488-dekstran tutarlar i?in Tart??ma) mRNA ve 3 kDa Alexa488-dekstran konjuge 29,30 E?-enjekte. B?lünme ba?lar kez bile mRNA da??l?m?n? ve floresan boya sa?lamak i?in hücrenin (de?il sar?s?) merkezine do?rudan enjekte edilir.
Not: Alexa488 sinyal hücre i?i ve hücre d??? floresan ay?rt etmek i?in b?lmeli maskeleri olu?turmak i?in veri analizi s?ras?nda kullan?lan olacakt?r.
Embriyo maddesi ile dolu bir alt?-?ukurlu, plastik ?anak 1-2% agaroz kapl? oyuk transfer enjekte embriyolar. Embriyolar ge? küre sahne 31 (yakla??k 5 saat sonra d?llenme) ula?ana kadar 28 ° C'de karanl?kta inkübe edin. Steromikroskopla embriyolar her biri 2 saat kontrol edin ve ?len embriyolar taraf?ndan olu?turulan herhangi bir enkaz kald?rmak.
2. P Zebra bal??? Embriyolar MontajBir Ters Konfokal Mikroskop üzerinde hotoconversion ve G?rüntüleme
04:59 sa?l?kl? embriyolar tespit ve ?anak bunlar? kald?rmak i?in bir Alevli ucu ile bir cam Pasteur pipet kullanmak i?in Stereomikroskopta kullan?n.
Yava??a 1x Danieau embriyo orta eridi% 1 dü?ük erime noktas? agaroz ~ 1 ml i?eren bir mikrosantrifüj tüp i?ine embriyolar ??karmak (?ekil 2A) (Malzemeler Listesi bak?n?z).
Not: Agaroz, 40 ve 42 ° C aras?ndaki bir s?cakl??a sahip olmal?d?r; yüksek s?cakl?klar embriyolar zarar verebilir.
Baz? agaroz ile birlikte geri pipet i?ine embriyolar ?izin. Yava??a bir cam alt ?anak (?ekil 2B) kapak cam?na agaroz ve embriyolar ??karmak. Kapak cam kal?nl??? konfokal mikroskop hedefi ile uyumlu oldu?undan emin olun.
?sterseniz cam pipet yeniden kullan?n. Pipet d??ar? kalan agaroz temizlemek ve yukar? ve a?a?? h?zla t?kanma, pipet embriyo orta ?nlemek i?in.A?a??daki Bu ama?la stereomikroskop embriyo ortam?n?n ~ 5 ml ile dolu bir 15 ml'lik tüp yerle?tirin.
Hayvan kutup (blastoderm) cam kapak bakacak ?ekilde embriyolar konumland?rmak i?in bir metal prob kullan?n. Agaroz 20-30 saniye i?inde kat?la?maya beri h?zla ?al???n. Embriyolar 'pozisyonlar? izlemek ve agaroz sertle?ir kadar gerekli yeniden ayarlamak i?in stereomikroskopta kullan?n.
Embriyo istenilen say?da monte edilene kadar tekrarlay?n 2,1-2,4 ad?mlar?.
Not: Tipik bir deneyde, d?rt ya da be? embriyolar her i?eren d?rt agaroz damla kapak cam?na kolayca uyum sa?layacakt?r. Yakla??k 16 embriyolar tek ideal bir deneyde (?ekil 2C) s?ras?nda g?rüntülenebilir.
Agaroz kat?la?m?? sonra, 1x Danieau embriyo orta ile cam alt ?anak doldurun.
3. Photoconverting ve Photoconverted Sinyal azalmas? ?l?me
Bir 25X veya 40X su amac? iboyut ve zebra bal??? embriyolar?n k?r?lma endeksi i?in uygun s. Su, be? saatlik deney s?ras?nda buharla??r beri, su yerine ger?ek su gibi ayn? k?r?lma indeksi ile dald?rma ya?? kullanmak en iyisidir. Dald?rma ya?? bir su (de?il ya?) amac? ile kullan?lmak üzere tasarlanm?? oldu?undan emin olun.
Objektif ve kapak cam aras?ndaki ya? filmi g?rüntüleme s?ras?nda farkl? embriyo pozisyonlara sahne hamle olarak k?rmak olmaz sa?lamak i?in objektif immersiyon büyük bir damla yerle?tirin. ?anak zaman sahne hamle kaymas? olmaz ki güvenli sahneye cam alt ?anak yerle?tirin. Mümkünse, 28 ° C, zebra bal??? geli?imi i?in en uygun s?cakl?kta bir ?s?t?lm?? b?lmesi kullan?rlar.
Konfokal mikroskop yaz?l?m paketinde her embriyonun konumunu tan?mlay?n. Her embriyo z-derinli?ini ayarlay?n ve her embriyo kabaca ayn? u?a?? hedef ?al??may?n.
Not: Yakla??k 30 mikron hayvan kutup bir gitmek oldu?unuEmbriyonun ku?at?c? tabaka ?nlenebilir, bu derinlikte beri od derinli?i, g?rüntüleme alan? maksimize edilir ve ???k sa??lmas? düzeydedir. ~ 3.3 um bir kal?nl??a sahip tek bir optik dilim yeterli veri sa? z-y???n? (bak?n?z B?lüm 5) elde etmek i?in herhangi bir ihtiya? vard?r.
Deney s?ras?nda iki sinyal toplay?n: Alexa488-dekstran &ye?il& sinyali e?lenik hangi photoconverted sonra hücre i?i ve hücre floresan-ve füzyon proteini &k?rm?z?& sinyali izole veri analizi s?ras?nda kullan?lacakt?r.
488 nm lazer kullanarak Alexa488 Excite ve ~ 500 ve 540 nm aras?nda yay?lan floresan toplamak. Not: Foto?evrim sonra ?ok say?da ye?il i?in k?rm?z? photoconvertible proteinler (?r Dendra2) bir 543 nm lazer ile uyar?lmas?na ve ~ 550 ve 650 nm aras?nda floresan yayabilir. Kullan?lan photoconvertible proteine dayal? olarak gerekli ayarlay?n.
Edinme &?n-Foto?evrim&G?rüntüleri ve g?rüntüye uygun g?rüntüleme ko?ullar? (ad?m 3.2) daha ?nce tan?mlanm?? pozisyonlar?n her konfokal mikroskop yaz?l?m?n? yap?land?rmak be? saatlik zaman kurs i?in her 10 veya 20 dakika (bak?n?z B?lüm 5 ve
Tart??ma).
Füzyon proteinini photoconvert i?in, 2 dakika boyunca% 100 ??k???nda bir ~ 300-400 nm eksitasyon filtreli bir c?va arkl? lambadan gelen UV ????? embriyo gruplar? 10X objektif ge?mek ve maruz kalmaktad?r. . Tekdüze Foto?evrim (B?lüm 5) te?vik etmek z-ekseni boyunca odak kaymas? dald?rma ya? Foto?evrim s?ras?nda 10x objektif üzerine damlamamas?n? emin olun.
Not: Foto?evrim s?ras?nda odaklama kayd?rma deneyi aras?nda de?i?kenlik ?nlemek i?in otomatik olarak yap?labilir.
Hemen Foto?evrim sonra geri 25X veya 40X objektif ge?in. Ad?m 3.2 daha ?nce tan?mlanm?? pozisyon hala do?ru oldu?undan emin olun. ?anak photoconv s?ras?nda kaym??t?r E?erersion, embriyolar?n pozisyonlar? yeniden tan?mlamak.
Ad?m 3.4 olu?turulan program?n? ba?lat?n ve g?rüntüleme 5 saat devam etmesine izin. Foto?evrim ve her embriyo i?in g?rüntüleme ba?lang?c? aras?nda ge?en süre unutmay?n.
Bazen deney kontrol. Danieau en ortam?n?n seviyesini izlemek ve gerekirse daha eklemek. O durdu, e?er yaz?l?m? yeniden ba?lat?n.
Katlanarak azalan modeli asimptota tahmin etmek i?in veri analizi s?ras?nda kullan?lacak e?i?e de?erlerini belirlemek i?in, deneyde Alexa488-dekstran ancak mRNA enjekte edilmi? baz? embriyolar? i?erir. Ayr?ca müteakip veri analizi s?ras?nda kullan?lacak alet gürültü, belirlemek i?in, bir numunenin yoklu?unda bir g?rüntü kazan?r.
4. PyFDAP kullanma Veri Analizi
G?rme her embriyo zaman ders veri setleri inceleyin. Imag s?ras?nda ?len embriyolar veri setleri at?nphotoconverted sinyalin ?ok dü?ük seviyelerde olmas?, ya da al???lmad?k bakmak ve hareketli ve (yaral? veya hasta embriyolar?n tipik) b?lünmesi durduruldu hücre b?lgeleri ihtiva ?nemli ?l?üde de?i?tirdi ing,.
Not: Bazen, immersiyon kabarc?klar? veya di?er eserler bir ba?ka kullan??l? veri kümesi i?inde bir ya da iki resim g?rünecektir. Eserler i?eren herhangi bir resim N daha sonra at?l?r ve bu veri setinden di?er zaman noktalar? yine analiz edilebilir.
FDAP verilerini analiz etmek i?in Python tabanl? yaz?l?m paketi PyFDAP kullan?n. PyFDAP her g?rüntünün ortalama hücre i?i ve hücre d??? k?rm?z? floresans yo?unlu?unu belirlemek ve katlanarak azalan i?levi 56 (?ekil 3) ile veri oturtulmas? ile yar? ?mürleri hesaplar.
PyFDAP ?ndir (bkz
Malzeme Listesi).
Kullan?m PyFDAP hücre i?i ve hücre d??? photoconverted sinyal (?ekil 3A, B) ay?rmak i?in. BizeBir hücre i?i maske olu?turmak i?in, kesinlikle i?i olan Alexa488 sinyali, e. Ortalama d??? yo?unlu?unu hesaplan?rken dü?ünülen hücre i?i piksel engellemek i?in gelen k?rm?z? kanal g?rüntü bu maskeyi uygulay?n. Ortalama hücre i?i yo?unlu?unu ?l?mek i?in, maske ters.
PyFDAP, ad?m 4.2.2 olu?turulan maskeli g?rüntüleri. G?rme bu g?rüntüleri incelemek ve maskeler do?ru d??? alandan hücre i?i (bu nadir olmal? ay?rt etmeye o hücre zarlar? d??? uzay maskeli edildi?i g?rüntülerde yer almaktad?r dikkat ancak e?ikleme de?i?tirerek kald?r?lm?? olabilir algoritmas? ya da bir zar maske sokulmas? (?rn kullan?larak membran CFP)). Ayr?ca ad?m 4.1 tan?mlanan eserler (?rne?in, immersiyon kabarc?klar?) i?eren herhangi bir tek g?rüntüleri at?n.
EAC ortalama hücre d??? ve hücre i?i floresan yo?unluklar? hesaplamak i?in PyFDAP kullanarakh g?rüntüsü. PyFDAP ?zetlenebilir toplam piksel say?s?na g?re maske ve b?lme d???nda kalan piksel yo?unluklar? toplanmas?yla bu ortalamalar hesaplar.
A?a??daki üstel fonksiyonu ile floresan verilerini (?ekil 3C) Fit:
t, zamand?r sonras? Foto?evrim, C (t), t, belirli bir de?erde yo?unlu?u oldu?u, c, 0, t = 0 yo?unlu?u, k temizlenme h?z? sabittir, ve y, 0 fonksiyonu floresan gibi yakla??mlar asimptot olan azalt?r (?ekil 1D). y, 0 ad?m 3.8 19 ?l?ümlere g?re k?s?tlanabilir.
A?a??daki ili?kiyi kullanarak temizlenme oran? sabitleri (k) hücre d??? ve hücre i?i protein yar?-?mürleri (τ) hesaplamak i?in PyFDAP kullan?n: <img fo:content-width = &1in& src = &/ files / ftp_upload / 52.266 / 52266eq2.jpg& width = &153& /&
5. Kontrol Deneyleri foto a?art?c?, istenmeden Foto?evrim ve Foto?evrim üniformlu?unu de?erlendirmek i?in
De?erlendirme
Not: ???kla a?artma ilgili proteinin klirens ek olarak floresan protein a?artma ?zelliklerini yans?tan, flüoresans yo?unlu?unda bir suni kayb?na neden olabilir.
Mümkün photobleaching de?erlendirmek g?rüntüleme ve g?rüntüleme aras?nda 20 dakika aral?klarla (?ekil 4) ile ikinci sette aras?nda 10 dakikal?k aral?klarla FDAP deneyler bir set yapmak. B?lüm 4&#39;de tarif edildi?i gibi PyFDAP kullan?ld??? deneylerde her iki seti verilerini analiz edin.
10 ve 20 dakika süre deneyler yar? ?mürleri kar??la?t?r?n. Daha uzun yar?lanma ?mürleri 20 dakika süre deneyler ?nemli photobleaching g?sterir. Her iki deneyden olan yar?-?mürleri ayn? ise, ???k birimiobleaching ?nemli bir endi?e de?ildir.
Alternatif olarak, hemen Foto?evrim sonra ~ 30 g?rüntülerin bir dizi sat?n alarak photobleaching de?erlendirmek. Flüoresans yo?unlu?unda ?nemli bir azalma ?nemli photobleaching g?sterir.
Photobleaching tespit edilirse, alt lazer gücünü kullanmak g?rüntüleme süresini azaltmak, ya da bir daha ????a photoconvertible protein 32 kullanmay? dü?ünün.
Yanl??l?kla Foto?evrim de?erlendirilmesi.
Not: Dendra2 488 nm ayd?nlatma 27 kullan?larak photoconverted edilebilir. 488 nm lazer ile verici Alexa488 ilgili proteinin belirgin yar? ?mrü a?ama 3.3.1 yanl??l?kla Foto?evrim ve bu nedenle suni art?? tarif edildi?i gibi zaman mümkündür. Ancak bizler ve ba?kalar? 33 488 nm ayd?nlatma zebra bal??? embriyolar Foto?evrim verimsiz bir y?ntem oldu?u bulunmu?tur.
Yersiz Foto?evrim tespit etmek i?in a?ama 5.1.1 tarif kontrol deneyini kullanarak. 10 ve 20 dakika süre deneyler yar? ?mürleri kar??la?t?r?n. 20 dakika süre deneylerden daha k?sa yar? ?mürleri ?nemli ?l?üde istenmeyen Foto?evrim g?stermektedir. Her iki deneylerden yar? ?mürleri ayn? ise, yanl??l?kla Foto?evrim ?nemli bir endi?e de?ildir.
Yanl??l?kla Foto?evrim tespit edilirse, Dendra2 photoconverting yanl??l?kla ?nlemek i?in daha dü?ük bir 488 nm lazer gücü ve daha k?sa g?rüntüleme kez kullanmak.
Foto?evrim tekdüzelik de?erlendirilmesi.
Not: Foto?evrim embriyo hayvan kutbuna do?ru bast?r?lmaktad?r ise, floresan azalma derin düzlemler (?ekil 5A); proteinin difüzyon ya da hücre hareketi ile etkilenecektir.
Foto?evrim düzgün olup olmad???n? belirlemek i?in, (hücre d??? füzyon proteinleri ile deneyler i?in), salg?lanan, photoconvertible protein ya da (hücre i?i füzyon proteinleri ile deneyler i?in), sitoplazmik photoconvertible proteini ifade eder. Her zamanki gibi Photoconvert ttavuk 80 dakika boyunca her 20 dakikada blastodermin en kapsayan z-y???n? kazan?r.
Foto?evrim hayvan kutup kar?? ?nyarg?l? ise, derin düzlemlerde floresan yo?unlu?u nedeniyle difüzyon veya hücre hareketi (?ekil 5B) zamanla artacakt?r. Muntazam olmayan Foto?evrim tespit edilirse, Foto?evrim s?ras?nda embriyonun i?ine derin odaklan?r. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
FDAP zebra bal??? embriyolar 19 hücre d??? sinyal g?nderme proteinleri yar? ?mürleri belirlemek i?in kullan?lm??t?r. Bu proteinlerden biri olan ?a??l?klar?n? embriyojenez 34 boyunca mesendodermal genlerin ekspresyonuna neden olur. ?a?? Dendra2 QRT-PCR ile ve in situ hibridizasyon deneyleri 19 de g?sterildi?i gibi, etiketsiz perspektif benzer seviyelerde mesendodermal genlerin ifadesini aktive eder. Embriyolar Alexa488-dekstran ve mRNA ?a?? Dendra2 kodlayan ve FDAP deneyine tabi ile birlikte enjekte edilir. Zaman i?inde hücre d??? photoconverted sinyal yo?unlu?unda bir azalma, belirgin (?ekil 4A) &#39;dir. 23 embriyolardan Hücre d??? yo?unluk profilleri PyFDAP kullan?larak elde edilmi?tir. Elde edilen veriler, bir birinci dereceden a??kl?k kinetik model ile PyFDAP monte edildi ve 116 dakika aras?nda bir ortalama yar?lanma ?mrü τ tekabül eden 1.00 x 10 -4 / sn aras?nda bir ortalama temizlenme oran? sabiti k, belirlenmi?tir. Benzer yo?unlu?u profilig?rüntüleme aras?ndaki aral?klar? o photobleaching veya yanl??l?kla Foto?evrim yo?unlu?u de?i?iklikleri (?ekil 4B) ?nemli ?l?üde katk? vermedi dü?ündüren, 10 ya da 20 dakika vard? s ve temizlenme oran? sabitleri elde edilmi?tir.
?ekil 1. Floresan ?ürüme sonra Foto?evrim (FDAP) genel bak??. (A) FDAP deneyi i? ak???. (B) mRNA enjeksiyon ve tek hücre a?amas?nda bir zebra bal??? embriyo bir floresan boya. Embriyo ?nce g?rüntüleme i?in yakla??k 5 saat boyunca geli?tik?e protein mRNA&#39;dan elde edilir. boya hücreleri (ye?il daireler) etiketleri. (C), füzyon proteini, bir UV darbesi kullan?larak photoconverted edilir ve zaman i?inde photoconverted sinyal yo?unlu?undaki bir azalma izlenir. (D) veri katlanarak azalan ile donat?lm??t?r Fonksiyon temizlenme oran? sabitleri (k) ve yar?-?mürleri (τ) elde etmek.
?ekil 2. FDAP deneyler i?in montaj Zebra bal??? embriyolar. (A) Zebra bal??? embriyolar (siyah blastoderm = beyaz, sar? =) agaroz eridi (sar?) i?ine embriyo orta (mavi) aktar?l?r. (B) Embriyolar ve agaroz, cam alt ?anak cam kapak üzerine yerle?tirilir. Hayvan kutup cam kapak bakacak ?ekilde Embriyolar sonra el konumland?r?lm??. Bir cam alt ?anak bir kesit g?sterilmi?tir. (C) d?rt embriyolar her (?anak i?ine bak?yordu g?rünümü) i?eren ?e?itli agaroz damla bir cam alt ?anak ?ematik bak??./files/ftp_upload/fig2large.jpg &target =& _ blank && bu rakam?n daha büyük bir versiyonunu g?rmek i?in buray? t?klay?n?z.
PyFDAP. (A) PyFDAP kullanarak ?ekil 3. Veri analizi hücre i?i Alexa488 sinyali (ye?il) den i?i ve d??? maskeleri olu?turmak i?in Otsu e?ikleme algoritmas? 35 kullan?r. Bir salg?lanm?? Dendra2 füzyon proteinini (?a??l?k-Dendra2 19) ifade eden bir embriyo (B) Photoconverted sinyali (k?rm?z?). Ortalama Ekstra ve hücre i?i floresan yo?unluklar? (A) &#39;da g?sterilen maskeleri kullanarak hesapland?. Embriyonun alan? d???nda sar? dairenin d???na piksel atarak bu hesaplamalar?n d???nda tutulmu?tur. (C) PyFDAP ekran bir FDAP deneyden d??? yo?unluk verilerini g?rüntüleyen (siyah CIRkart?lmas?) bir katlanarak azalan fonksiyonu (k?rm?z? kesikli ?izgi) ile donat?lm??. d??? yar?lanma ?mrü k?rm?z? ok ile g?sterilir.
?ekil 4. Temsilcisi FDAP sonu?lar?. (A) ifade bir temsilci embriyo Foto?evrim (solda) ve 27, 87, ve 287 dakika sonras? Foto?evrim i?in ?a??l?k-Dendra2 hemen ?nce salg?lanan. (B) photobleaching ve yanl??l?kla Foto?evrim (B?lüm 5) kontrol etmek i?in, 10 veya 20 dakika aral?klarla deneyler yap?ld? (Müller ve ark. Veri, 2012 19). PyFDAP olarak, hücre d??? bir yo?unluk profili, olu?turulan katlanarak azalan fonksiyonlar? ile donat?lm?? ve subtrac ile normalizeting 0 de?eri c donat?lm?? her veri noktas? ve b?lme gelen donat?lm?? y 0 de?eri. Aral?k deneyler vard? 10 dakika (siyah, n = 11) ve 20 dakika (mavi, n = 12) elde edilen veriler daha sonra s?ras?yla, ortalama. Hata ?ubuklar? standart sapma g?sterir.
Photoconverted protein zamanla daha derin u?aklar? i?ine yay?l?r e?er ?ekil Foto?evrim tekdüzelik de?erlendirilmesi 5.. Ekstraselüler proteinin (A) düzgün olmayan Foto?evrim bir yanl??l?kla k?sa belirgin yar?lanma ?mrü yol a?abilir. (B) Foto?evrim üniforma olup olmad???n? belirlemek i?in, birka? seferde kazan?l?r blastodermin ?o?unu kapsayan bir z-y???n sonras? photoconvers puanlar?iyonu temsil etmektedir. Foto?evrim düzgün olmayan (???k sa??lmas? yüksek u?aklar?n daha s?nük g?rünmesine derin u?aklar? neden oldu?unu unutmay?n) ise floresan yo?unlu?u zamanla daha derin u?aklar? artacakt?r.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Bir FDAP deney ba?ar?s? fonksiyonel photoconvertible füzyon proteininin üretimi dayan?r. Bir protein etiketleme onun biyolojik aktivitesini ve / veya yerle?im yeri, ??zünürlük ve stabilite 36-41 dahil olmak üzere biyo-fiziksel ?zelliklerini etkileyebilir. Aktif aktiviteleri i?in ?ok say?da farkl? füzyon yap?lar?n?n aktivitesi test etmek i?in haz?rlanabilir. Bunun ?tesinde ilgili protein i?in photoconvertible proteini g?re konumunu de?i?tirmek veya daha fazla ba?lay?c?lar ile (?rne?in, amino asit sekans? LGDPPVAT 19 kullan?larak) füzyon proteininin aktivitesini art?rabilir. Sinyal proteinleri durumunda, füzyon proteinin aktivitesi, hedef genlerin 19 ekspresyonunu indükleme yeteneklerinin test edilmesi suretiyle tespit edilebilir. QRT-PCR, in situ hibridizasyon, hedef gen ekspresyonu 19 iyi okumalar?n? sa?layabilir. Tasarlanm??t?r Burada a??klanan protokol proteinlerin stabilitesini belirlemek i?in dikkatErken Zebra bal??? embriyo ve di?er ba?lamlarda protein istikrar? de?erlendirmek i?in de?i?iklik gerektirecektir.
Ye?il-to-k?rm?z? photoconvertible protein Dendra2 27 Zebra bal??? FDAP deneyler 19 (?ekil 4) ba?ar?yla kullan?lmaktad?r, ancak di?er se?enekler kullan?labilir 26,42 vard?r. Nedeniyle füzyon proteini birikiminin potansiyel eserler ?nlemek i?in, bir monomer photoconvertible proteini se?in. Ayr?ca FDAP kullan?labilir Photoactivatible proteinler 20-22,26 deneyleri.
Bir FDAP deney yapmadan ?nce, protokolün birka? y?nleri optimize edilmesi gerekir. Foto?evrim sonra kullan?labilir sinyali sa?layan en dü?ük miktar?n? belirlemek i?in mRNA farkl? ~ 50 ug mRNA iyi bir ba?lang?? miktar?d?r. Anlaml? kompartmental maskeleri olu?turmak i?in (?ekil 3), Alexa488 sinyal yeterince parlak olmal?d?rsürekli olarak enjekte mRNA&#39;dan üretilen olmayan photoconverted füzyon protein floresan boya optimal miktarda bulmak i?in Alexa488-dekstran ng 0.2 aras?nda ve 4 enjekte. Optimal sonras? d?nü?üm g?rüntüleme ko?ullar?n? bulun ve belirli bir yap? ile tüm deneyler i?in ayn? ko?ullar kullan?n. 43 uygulamalar? iyi kantitatif g?rüntüleme kullan?n ve k?rm?z? kanalda doymu? piksel ?nlemek i?in uygun bir dinamik aral??? se?in. Her bir füzyon proteini i?in uygun g?rüntüleme aral???n? belirler. ?ok k?sa bir yar? ?mre sahip proteinler, daha k?sa bir toplam zaman süresi boyunca daha s?k g?rüntüleme gerektirebilir. Kullan?lan organizma ve photoconvertible protein g?re optimum Foto?evrim tekni?i kurmak. Biz ad?m 3.5 bir c?va ark lambas? kullanarak bir sa?lam Foto?evrim y?ntemi tarif, ama Dendra2 da 405 33 veya 488 nm lazer 27 photoconverted edilebilir.
Bir liBu FDAP protokolünün mitation ilgilenilen proteinin a??r? ekspresyonu gerekli olmas?d?r. A??r? ekspresyonu, protein a??kl?k kinetik 14,44 ve de?i?iklikler di?er genlerin anormal sentezlenmesi yoluyla, ?rne?in, proteinin stabilitesini etkileyebilir. ?lgi dahilindeki protein bir sinyal molekülü ise, hedef genlerin ekspresyonunu bloke protien stabilitesi üzerindeki olas? etkilerini belirlemek i?in bir sinyal inhibit?rünün varl???nda deneyler dü?ünün. Gelecekte, endojen sentezleme elemanlar? 45-50 kontrolü alt?nda photoconvertible füzyonlar?n?n ifade eden transgenik embriyo üretilmesi mümkün olabilir. Transgenik embriyolar yeterli sinyal üretmek halinde olmayan bir a??n ba?lam?nda FDAP deneyleri, belki de tüm embriyo 51 floresan azalma g?zlemlemek i?in ???k-mikroskopisi kullan?larak levha, dü?ünülebilir.
FDAP olas? ba?ka uygulamalar mekanizmalar? tha ara?t?ran i?erirt farkl? perturbations (varsay?lan proteazlar ?rne?in, ifadesi) veya istikrar protein modifikasyonlar? (?rne?in, fosforilasyon) etkilerini inceleyen protein istikrar? düzenler. ?rne?in, ?a??l?k d??? dengesini kontrol fakt?rler henüz bilinmemektedir. Bir?ok salg?lanan geli?imsel sinyaller d??? uzaydan ?a??l?k ve di?er ligandlar?n temizlenmesi katk?da bulunabilir hücreleri 52-55, taraf?ndan i?selle?tirilir. FDAP deneyleri hangi i?selle?tirilmesi d??? protein a??kl?k kontrol mekanizmalar? hakk?nda bilgi sa?layabilir engellendi.
Protein stabilitesini 15 ?l?mek i?in geleneksel deneylerde aksine, FDAP proteinlerin temizlenme canl? organizmalar zaman i?inde izlenebilir olan bir mikroskop bazl? bir alternatif sunar. Benzer y?ntemler, zebra bal??? embriyolar ba?ka model sistemlerinde protein a??kl?k izlemek i?in kullan?lm??t?r 20-23. Bu FDAP protokol potansiyeline sahip canl? g?rüntüleme mümkündür biyolojik sistemlerde herhangi bir taggable proteinin yar? ?mrünü saptamak i?in adapte edilmelidir. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Yazarlar if?a etmek ?at??malar? hi?bir var.
Yazarlar yaz?n?n yorumlar? i?in Jeffrey Farrell, James Gagnon, ve Jennifer Bergmann te?ekkür etmek istiyorum. KWR FDAP testinin geli?tirilmesi s?ras?nda Ulusal Bilim Vakf? Lisansüstü Ara?t?rma Bursu Program? taraf?ndan desteklenmi?tir. Bu ?al??ma AFS NIH hibe yoluyla ve Alman Ara?t?rma Vakf? (Emmy Noether Program?), Max Planck Kurumu ve PM ?nsan Frontier Bilim Program? (Kariyer Geli?tirme ?dülü) hibe ile desteklenmi?tir.
Catalog Number
PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)
Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit
Life Technologies
To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa
Life Technologies
Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish
Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium
250 mg/L Instant Ocean salt, 1&mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus
Make a 5 mg/ml stock and use at 1&mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass Petri dish
For embryo dechorionation
200 ml glass beaker
For embryo dechorionation
Microinjection apparatus
For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope
For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium
Dilute low melting point agarose and perform im recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5&mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose
Invitrogen
F use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1&ml into m aliquots can be stored at 4 &C, re-melted at 70&&C, and cooled to 40&#8211;42 &C when ready to use
Glass Pasteur pipette
Kimble Chase (via Fisher)
F flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe
For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes
P35G-1.5-14-C
Use the appropriate cover glass thicknes part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium
For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope
A mercury arc lamp, 488&nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage
To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging
Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&
25X or 40X water objective
Objective for imaging
10X air objective
Objective for photoconversion
Immersion oil
Immersion oil with the same refractive index as water
Schwanh?usser, B., et al.
Nature. 473, (7347), 337-342 (2011).
Boisvert, F. M., et al.
Molecular & Cellular Proteomics. 11, (3), 12).
Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (35),
Eden, E., et al.
Science. 331, (6018), 764-768 (2011).
Parry, D. H., O'Farrell, P. H.
Current Biology. 11, (9), 671-683 (2001).
Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W.
Cell. 73, (7),
Dharmasiri, N., Estelle, M.
Trends Plant Sci. 9, (6), 302-308 (2004).
MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X.
Developmental Cell. 17, (1), 9-26 (2009).
Chen, X., et al.
The Journal of Cell Biology. 192, (5), 825-838 (2011).
Elmore, S.
Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
Yi, J. J., Ehlers, M. D.
Pharmacological Reviews. 59, (1), 14-39 (2007).
Rubinsztein, D. C.
Nature. 443, (7113), 780-786 (2006).
Müller, P., Schier, A. F.
Developmental Cell. 21, (1), 145-158 (2011).
Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N.
Developmental Cell. 5, (4), 635-646 (2003).
Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
Woodside, K. H.
Biochim Biophys Acta. 421, (1), 70-79 (1976).
Schimke, R. T., Doyle, D.
Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
Kenney, F. T.
Science. 156, (3774), 525-528 (1967).
Müller, P., et al.
Science. 336, (6082), 721-724 (2012).
Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K.
The Journal of Cell Biology. 193, (2), 365-380 (2011).
Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P.
Nature Cell Biology. 13, (2), 17-123 (2011).
Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E.
Biophys J. 101, (8),
Zhang, L., et al.
BioTechniques. 42, (4), 446-450 (2007).
Miyawaki, A.
Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (10), 636-668 (2011).
Pantazis, P., Supatto, W.
Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (5), 327-339 (2014).
Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V.
Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (11), 885-891 (2005).
Gurskaya, N. G., et al.
Nature Biotechnology. 24, (4), 461-465 (2006).
Zou, J., Wei, X.
Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
Yuan, S., Sun, Z.
Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D.
Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
Developmental Dynamics. 203, (3), (1995).
McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L.
Nature Methods. 6, (2), 131-133 (2009).
Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P.
Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
Schier, A. F.
Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1, (5), a).
IEEE Trans Syst Man Cybern. 9, (1), 62-66 (1979).
Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S.
Nature Biotechnology. 24, (1), 79-88 (2005).
Swulius, M. T., Jensen, G. J.
Journal of Bacteriology. 194, (23),
Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J.
Nature Methods. 9, (5), 480-482 (2012).
Stadler, C., et al.
Nature Methods. 10, (4), 315-323 (2013).
Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R.
Trends Plant Sci. 18, (9), 473-476 (2013).
Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T.
PLoS ONE. 6, (5), e1).
Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y.
Nature Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
Waters, J. C.
The Journal of Cell Biology. 185, (7),
Moll, U. M., Petrenko, O.
Mol Cancer Res. 1, (14),
Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F.
Genome Research. 24, (1), 142-153 (2014).
Bedell, V. M., et al.
Nature. 491, (7422), 114-118 (2012).
Hruscha, A., et al.
Development. 140, (24),
Hwang, W. Y., et al.
PLoS ONE. 8, (7), 6).
Hwang, W. Y., et al.
Nature Biotechnology. 31, (3), 227-229 (2013).
Zu, Y., et al.
Nature Methods. 10, (4), 329-331 (2013).
Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K.
Science. 322, (5904),
Blanchet, M. H., et al.
Science Signaling. 1, (45), ra13-ra13 (2008).
Jullien, J., Gurdon, J.
Genes & Development. 19, (22),
Incardona, J. P., et al.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (22),
Scholpp, S., Brand, M.
Current Biology. 14, (20),
Bl?ssle, A., Müller, P. . In Press, forthcoming (2014).
You must be signed in to post a comment. Please
Related Videos
Table of Contents - Journal Issues
Publish in JoVE
Subscribe to JoVE
Sharing JoVE
Copyright &#xa9; JoVE . All Rights Reserved. |
| ISSN XMyJoVE Corp. | One Alewife Center, Suite 200 | Cambridge, MA | 02140 | tel.}