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阿尔茨海默病患者和正常对照人群血浆抗Aβ40 、Aβ42抗体的研...
&Plasma antibodies to A40 and A42 in patients with Alzheimer's disease and normal controls
（患者和正常对照人群血浆抗Aβ40 、Aβ42抗体的研究）
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& Wuhua Xu, et al. Brain Research ):169-179.
1.&&&&&& 前言
阿尔茨海默病（AD）大脑两个恒定的病理标志物分别是：最初以细胞外Aβ40和Aβ42沉积为特征的淀粉样变性，以及随后出现的以异常磷酸化tau组成的神经纤维缠结（NFT）在神经细胞内堆积为特征的tau病（tauopathy）样改变。自从家族性AD相关性APP、PS1、PS2基因突变被证实显著增加细胞外Aβ42和纤维性Aβ浓度以来，Aβ一直被视为启动所有类型AD病理机制的罪魁祸首，其中Aβ瀑布假说已经成为诠释AD病理机制的主流学说，也成为了AD临床治疗的最重要标靶。一系列转人类APP基因的模型小鼠大脑中展示了大量的Aβ斑块对这一假说提供了强有力的支持，而Tg2576×tauP301L双转基因AD模型更是为Aβ促进NFT形成提供了直接的证据。
近年的研究表明，Aβ免疫治疗依然是AD临床最有前景的选择之一。Schenk以及其他小组的研究结果显示，无论是采用Aβ42疫苗进行的主动免疫，还是采用抗Aβ抗体进行的被动免疫治疗都有效地减少转基因小鼠或患者脑内的Aβ负荷，从而表明外周抗Aβ抗体对AD患者可能起着保护性作用。在AN1792第I阶段临床试验中，25%的实验者外周血的抗Aβ42抗体滴度明显升高，而ELISA分析发现，在试验第II阶段中发生脑脊髓膜炎并发症的患者中，80%（12/18）患者血清和75%（6/8）患者脑脊液可检测到抗Aβ42抗体，但抗体的滴度与并发症发生有否、严重程度和复发几率无关。
Gaskin等（1993年）首次在AD患者的B细胞系中检测到自身抗Aβ40抗体，随后Du等（2001年）采用ELISA方法报道了抗人工合成的Aβ40多肽抗体可自然发生于健康对照者和AD患者的血浆和脑脊液，而Weksleretal等（2002年）和Nath等（2003年）先后报道了AD患者（和老年转基因小鼠）血浆抗Aβ42多肽抗体滴度低于或高于健康对照组。在大约50%老年人群中也可检测很低水平的自然发生的抗Aβ42抗体，其中5%的抗体滴度处于中等水平，但它们的出现和滴度与AD诊断、发病年龄以及血浆Aβ40、Aβ42水平缺乏必然的联系（Hyman et al,2001年）。而Baril等（2004）则观察到抗Aβ40抗体和抗Aβ42抗体可以同时出现于AD患者、对照组，甚至年较轻的人群中。因此，之前关于自身抗Aβ抗体的研究结果是复杂和相互矛盾的。
在AN1792第II阶段临床试验因5%的患者出现非特异性脑脊髓膜炎而被迫中止之后，采用组织淀粉样蛋白免疫反应检测方法（tissue amyloid plaque im TAPIR），多个研究均观察到AN1792疫苗接种后所产生的抗Aβ42抗体可显著地减慢患者认知功能以及日常生活能力的下降速度，从而提示抗β淀粉样斑块抗体（antibodies to β AAP）对AD患者的保护性作用。为了进一步明确AAP的自然发生率、免疫特性以及与AD临床之间的关系，我们对113例AD患者和155例年龄匹配的健康对照者(age-mat aNC)的血浆进行了TAPIR研究，同时还调查了AD和年龄相关性的血浆Aβ水平的变化，并以此验证AAP对外周血浆Aβ变量的调节作用。
2.1 AD组和aNC组均出现较高的TAPIR阳性率，但两组之间无显著性差异
如图1所示，部分来自AD组和aNC组的TAPIR++ 血浆能够如标准抗Aβ抗体-Ab9204染色一样，清晰地标识几乎所有的Tg2576小鼠脑组织中的老年斑核心（ SPCs）（图1A, B,I），而来自其他组的血浆样本表现出阴性（图1D,E,F），弱阳性(图1G)，或者标识出阳性（图1H）。由于TAPIR染色采用的是抗IgG第二抗体，并不与抗IgM或
（图1显示的是采用血浆和Tg2576小鼠脑组织进行的TAPIR研究结果。按照老年斑核心的染色深度和数量对TAPIR结果进行分级，图1中的F~I代表的是TAPIR结果的分级标准，由左及右分别为TAPIR-、TAPIR±、TAPIR+，TAPIR++。与标准抗Aβ抗体-Ab9204抗体染色结果（C）比较，AD组（A）和aNC组（B）中的TAPIR++血浆能够强烈标识Tg2576小鼠脑组织中大多数老年斑，而两组中的TAPIR-血浆则不能（D，AD组；E，aNC组）部分AD患者和aNC）
IgA抗体发生交叉反应（资料未显示），因此可以认为，本研究中的TAPIR阳性抗体为IgG抗体，并在2.3中描述的Aβ免疫沉降过程中得到证实。
在113例AD患者中，42例（37.2%）为TAPIR-，20例（17.8%）为TAPIR±，44例（38.9%）为+，7例（6.2%）为（++），总的阳性例数为51例（45.1%），提示自然发生的抗淀粉样蛋核心抗体（AAP）频繁发生于AD患者。这一现象也发生在aNC组中，155例aNC中TAPIR-、TAPIR±、TAPIR+、TAPIR++的例数和发生率分别为54例（34.8%）、37例（23.9%）、44例（28.4%）以及20例（12.9%），因此aNC组中总的阳性例数和发生率为64例（41.3%）。Mann-Whitney's U检验结果显示，AD组和aNC组之间的AAP发生率无显著差别（p=0.77），亚组分析还显示：无论是在AD组，还是aNC组中，各种TAPIR分级结果之间也无显著差别（p=0.54）（见表1） 。
（表1：AD组和aNC组的人口资料和TAPIR结果汇总，yr代表年，mo 代表月）
2.2. TAPIR结果与临床症状无关
AD组和aNC组的性别和年龄无显著性差异（见表1）。根据AD组的TAPIR结果将患者分为TAPIR-组、TAPIR±组、TAPIR+组，TAPIR++组四个亚组，分析各亚组之间的MMSE评分和疾病病程之间的差异缺乏统计学意义（见表1和图2A,B）。随后观察各TAPIR分级亚组患者在疾病自然进程中的MMSE的月下降速度也表明：TAPIR结果与进程亦无显著差异（图2C）。因此，通过TAPIR方法检测到的AAP并不能改善AD患者的临床预后。
（图2显示TAPIR结果与临床症状以及病程之间的关系。其中AD组的TAPIR分组的MMSE评分的月下降速率分别为：（1）TAPIR－组：Y=-0.09X+19.54, r =0.19, p=0.01; （2）TAPIR ±组：Y=-0.06X+18.50, r =18.50, p=0.52; (3) TAPIR +组：Y=0.12X+20.59, r =0.17, p=0.02; （4）TAPIR＋＋组：Y=-0.06X+18.63, r =0.04,p=0.72。）
2.3 TAPIR阳性血浆主要识别并结合Aβ40、FAβ，但与Aβ42仅有微弱的亲和力
如图3所示，新鲜制备的Aβ40和Aβ42主要呈现为Aβ单体和二聚体，而蚁酸抽提的脑组织Aβ则显示出明显的多聚化趋势（见图3左侧小图）。将分别来自AD组和aNC组的TAPIR+和TAPIR++血浆与上述Aβ进行免疫沉降发现，这些血浆能够结合单体、二聚体以及多聚体形式的Aβ40，但与Aβ42的亲和力十分微弱，从而提示本研究中的TAPIR阳性AAP与Aβ所发生的免疫反应主要是与Aβ40。
（图3. TAPIR阳性血浆与不同Aβ进行免疫沉降的结果）
2.4 AAP可能出现在Aβ沉积发生之前
为了进一步查明AAP开始出现的年龄，我们另外检查了50例年龄&43岁年轻对照者标本。令人吃惊的是，TAPIR出现在一名2岁儿童以及其他各个年龄段的年轻健康对照血浆中（见图4A,B,C）。其中10岁组和20岁组的阳性率分别高达57%（4/7）和64%（6/11），而30岁组和四十岁组的阳性率较低，分别为20%（2/10）和10%（1/10）（见图4J）。采用同样的免疫沉降方法分析上述年轻健康对照者中的TAPIR阳性血浆显示，其免疫特性与AD组和aNC组中的TAPIR阳性血浆几乎完全一致（见图4 D、E、F）。
（图4显示年轻健康对照者和幼龄Tg2576 小鼠血浆TAPIR阳性率以及其免疫特性）
上述现象同样发生在幼龄Tg2576小鼠血浆中。4、8、16月龄的转基因小鼠血浆均能不同程度地识别AD患者脑组织中SPC（图4G,H,I）。
最后，我们总结了各个年龄段TAPIR阳性AAP在所有年龄段中分布规律，发现具有明显的年龄依赖性：在1~20岁的年龄段较高，随后下降并在50岁之后再次升高。在AD组和aNC组中的总体发生趋势则是随着年龄的增长而增加（图4J）。
2.5 血浆Aβ40和Aβ42水平具有年龄依赖性变化
为了检测AAP对血浆Aβ水平的影响，我们采用一种特殊的双抗体夹心系统ELISA检测了包括AD组和tNC组在内的所有318例血浆标本。在tNC组Aβ40水平在40岁以后增高（图5A；p&0.0001），相反，Aβ42水平在青少年健康者中增高，然后随着年龄的增长逐渐下降（图5B;p=0.0158）。Aβ比率（Aβ40 /Aβ42）在30岁之前保持稳定，然后逐渐增加（图5C；p&0.0001）。
（图5.ELISA结果显示血浆Aβ水平呈现年龄依赖的特征性变化。）
2.6 AD组的血浆Aβ比值明显增高aNC组，并可作为辅助性诊断指标。
相对于aNC组(95.38± 32.30; p&0.0002; Fig. 5D)，AD组患者血浆Aβ40水平显著增高（112±39.51 pmol/L)。而与aNC组比较（12.13±12.29 pmol/L），AD组的;）Aβ42水平却显著降低(10.29±13.80 pmol/L；p&0.0001; Fig. 5E)。基于此变化，相对于aNC组（8.34±3.83;p&0.0001; Fig. 5F）AD患者中血浆Aβ比值大幅度增高(14.42±10.00)。Aβ比值的ROC曲线分析表明其cun-off值是9.0，在这一点上，具有临床诊断AD最高的灵敏度（78.8%）和最低的特异度（30.3%）。如果用aNC组的X+2 SD (15.9)作为cun-off值，那么灵敏度就变成了24%，特异度为96%。当AD患者按照临床病程分为早中晚三个小组，那么随着病程的发展，Aβ40水平和Aβ率逐渐增加，Aβ42水平逐渐下降（图5G~I）。因此，血浆Aβ比值可作为AD诊断的辅助性生物标记物，虽然，其灵敏度和特异度比脑脊液样本要低(Kanai et al., 1998; Shoji et al., 2001; Shoji, 2002)。
2.7 TAPIR阳性AAP不能修饰Aβ浓度
最后，我们分析了抗Aβ抗体是否能影响血浆Aβ40和Aβ42水平。通过不同TAPIR值，我们发现AD和aNC组之间，血浆Aβ40或者Aβ42的聚集，以及Aβ率无明显差别（图6A~C）。
（图6：TAPIR分级结果与血浆Aβ变量之间缺乏显著性相关关系）
我们的研究表明，一个高TAPIR阳性发生率出现在AD组和aNC组中，它们分别为45.1%和41.2%，两组之间比较无显著性差异。进一步的分析也没有发现在两组内的TAPIR分级亚组之间存在显著性差异。非参数分析表明，无论是MMSE，还是疾病病程均与TAPIR结果无关，这表明自然产生的抗Aβ抗体的生理作用缺乏具有统计学意义的临床价值。我们的结果符合以前关于低水平抗Aβ40或Aβ42多肽抗体的研究报道，这些抗体可以用ELISA法在血浆和脑脊液中检测到。Hyman等通过ELISA方法进行的大样本研究发现，在365例AD和年龄匹配的对照组的血清样品中，分别有52.3%和4.7%存在这中低度的抗Aβ42抗体。而且这些抗体的存在与血清浓度，以及血浆Aβ40和Aβ42均无法预测AD的发生，也无法预测AD患者的预后。我们的研究表明，TAPIR阳性的AAP也经常发生人的血浆中，并且他们的效价不足以防止AD的发展。因此，我们认为在采用Aβ疫苗进行的主动免疫治疗或者通过输注抗Aβ抗体的被动免疫治疗AD患者时，需要提高抗Aβ抗体的滴度才可能达到预期的效果。
TAPIR是一种检测抗Aβ抗体的新型方法。从Aβ疫苗主动免疫后患者产生了高滴度的抗Aβ抗体并出现显著的认知功能改善这一事实使我们有理由相信，TAPIR阳性的AAP与自然产生的抗Aβ肽抗体对于识别Aβ40和Aβ42类型或构Aβ寡聚体的表象上存在着显著的差异。事实上，相比被动免疫时采用的抗体，AAP表现出更卓越的清除转基因小鼠脑内Aβ负荷功效。AAP可能是透过血脑屏障并通过抗体的FC或非FC段直接作用于斑块的崩解，而不需要T细胞的分化增殖和小胶质细胞的清除作用。IgG2a抗体与Aβ的特定N -末端区域结合可能与Aβ清除机制相关。而注射用的抗Aβ抗体可能是通过结合并挤脱血液中的Aβ，干扰脑脊液与外周血之间的Aβ动态平衡，从而使得Aβ清除机制更多地倾向于从脑组织到外周血方向。近年来，对认知功能具有损害作用的可溶性Aβ寡聚物被认为是被动免疫治疗的另一个标靶。最近，一种分子量为56 kDa的可溶性β -淀粉样聚合体（Aβ*56的）被证实AD病人的脑脊液中升高并对记忆功能具有明显的破坏作用。
这些报道都支持这一假设，即自然出现的针对TAPIR阳性AAP能够识别特殊类型的Aβ。我们的免疫沉降研究表明，来自于AD组和aNC组的TAPIR + + / +血浆对Aβ40单体及二聚体以及较高分子量的聚合物具有较高的亲和力，而对Aβ42的亲和力却十分微弱。在我们的测试条件下，没有任何形式的Aβ42二聚体被检测到。TAPIR阳性血浆中缺乏抗Aβ42二聚体抗体以及抗Aβ42单体偏低是本研究发现的自然AAP的特点，并可能是其不足以防治AD的原因之一。
值得一提的是，这些AAP在年轻人以及幼龄Tg2576小鼠中也被明确地发现。因此，我们的TAPIR检测还表明，自然发生的AA贯穿于人的一生。相对而言，最高的TAPIR阳性率阳性率出现在青少年期，其次是老年期，最低的是中年或老年前期。随后的研究也发现，在免疫沉降过程中这些年轻血浆中的TAPIR阳性AAP主要也是与Aβ单体、二聚体以及分子量较高的寡聚体结合，而很少与Aβ42二聚体结合。在我们有限的检索中，这是首次关于年轻个体血浆存在选择性倾向于Aβ40（而不是Aβ42）的免疫亲和力的报道。我们的研究还表明，正常老年人和AD患者对Aβ的免疫反应存在着相似的免疫应答，因此，抗Aβ42抗体自发性生成障碍同时发生在两组人群之中。目前尚不不清楚为什么这些TAPIR阳性的AAP会更频繁的出现在年轻人和老年人群中，以及为什么机体会出现对Aβ42单体和寡聚物的特异性免疫耐受。值得注意的是，这些出现TAPIR阳性AAP的年轻人和幼龄Tg2576幼小鼠大脑并不没有形成Aβ斑块，因此我们的研究结果提示了这些抗体的出现与大脑内的Aβ负荷无关。
AAP自然发生的确切机制依然不明。虽然已发现转基因动物模型大脑、血浆、脑脊液中Aβ42水平呈现明显增加的趋势，Monsonego等的研究也证实了机体存在着对Aβ42的低免疫反应。同时，在老年健康人群和AD患者中观察到增强的Aβ42－特异性T细胞活性。但是以前的研究和我们的结果都没有显示在这些群体的血浆中伴随着抗Aβ42抗体滴度的增加。因此，对Aβ42尤其是对Aβ42寡聚体的的免疫低下状态的确存在于AD患者和健康人群之中。尽管Aβ42有高致病性和神经毒性，但机体免疫系统对Aβ42的免疫应答可能受到屏蔽和和抑制。我们认为，为了达到在转基因小鼠研究和Aβ疫苗试验中的Aβ免疫治疗效果，有必要研发特异性针对Aβ42单体和寡聚物的抗体并和监测其滴度。此外，为了防止在AN1792第二阶段临床试验中出现的不良反应，建议在治疗之前，对这些自发性抗Aβ抗体进行检测。
最近研究表明，血浆Aβ40和Aβ42浓度是AD潜在的生物学标志物，并且可用于AD特异性治疗效果的监测。DeMattos等的研究表明，静脉注射抗Aβ抗体后，转基因小鼠血浆中迅速增加的Aβ水平与其大脑中淀粉样蛋白负荷密切相关，这提示自然发生的AAP也有可能增加血浆Aβ浓度。为了论证这一推测，我们检测了包括各个年龄段的tNC 组样本，发现其Aβ40和Aβ42 水平呈现出年龄相关性变化。同时，根据AD组AAP出现与否比较分析了Aβ变量的变化。在tNC组中，血浆Aβ40水平从40岁年龄段开始升高，而Aβ42水平在10岁和20岁之间升高，然后随着年龄逐渐下降。Aβ比值（ Aβ40/Aβ42 ）在30岁之前一直保持稳定，然后随着年龄逐渐升高。血浆中Aβ变量的时间变化规律与我们以前在脑脊液研究中发现的Aβ40水平变化规律完全一致，但是与脑脊液中的Aβ42水平变化规律正好相反。脑脊液中的Aβ40和Aβ42水平呈U型年龄相关曲线，与大脑发育和衰退规律一致。在本研究突出体现出的抗Aβ40抗体与升高的血浆和脑脊液Aβ40水平之间的相关性，暗示了机体未成熟阶段免疫系统可能更多地暴露在Aβ40单体和多聚体的环境之中，或者大脑的衰退可能是机体对Aβ40产生自然免疫应答的源泉。
本研究所展示的血浆中Aβ浓度的自然变化规律，以及AD组与aNC组之间的比较分析结果对于AD临床以及发病机制具有一定的启示性意义。与aNC组相比，AD组患者的血浆Aβ40水平和Aβ比值明显升高，但Aβ42水平显著下降。由于两组之间的Aβ比值存在着显著性差异，可以考虑作为诊断或监测AD的生物学指标。ROC分析表明，当X+2 SD (15.9)作为cut-off值时其对AD的诊断具有高敏感性和低特异性（其中敏感性为24%，特异性为96%）。根据MMSE评分对AD患者进行临床分期发现，Aβ比值从早期到后期呈进行性增长。这些发现表明，尽管血浆Aβ比值对于AD诊断和临床检测的敏感性和特异性低于脑脊液，但是由于其简易和非创伤性的，因而可以作为有一定辅助价值的生物学指标。
本研究还发现，自然产生的抗Aβ抗体（AAP）并不影响血浆Aβ40、Aβ42水平以及Aβ比值。有一种可能的解释是，我们的ELISA系统并不能检测到Aβ40或Aβ42寡聚体水平。然而综合其他研究结果，更可能的原因可能是这些自然产生的抗Aβ抗体的滴度和特异性尚并不足以增加Aβ血浆浓度，促进Aβ从脑到外周的清除，并改善相应的临床症状。因此，在未来的AD免疫治疗策略中应该充分考虑提高抗Aβ42寡聚体抗体的滴度，以加快脑内Aβ的清除。
&& 4.实验步骤
4.1 AD患者和正常对照组
&所有318例试验者，包括113例AD患者（AD组）和包括各个年龄段的205例正常对照组（tNC组）签署知情同意书后，其全血样本被收集在加入0.1%的EDTA试管中，并随后制备成血浆，储存在−80℃。从tNC组中选取的115名年龄≥43岁正常对照组组成aNC组。各组的实验数据总结在表2，所有AD患者诊断均采用NINCDS-ADRDA标准，辅助检查包括头颅MR及SPECT检查被用于排除其他类型的痴呆疾病。简易精神状态调查表（MMSE）用于AD患者的临床症状严重程度的判断，并按照评分结果将患者分为以下3组：早期组（MMSE分数&20），中期组（MMSE分数10-20），晚期组（MMSE分数&10）。正常对照组的评判基于其MMSE评分&28并在随后的神经病学检查不符合痴呆的诊断。
4.2组织淀粉样免疫性
从月龄16-18月大小的Tg2576小鼠或阿尔茨海默病患者的大脑组织取材，切成厚度为5μm的连续石蜡组织切片。切片在浸入0.5%过碘酸溶液浸泡阻止内源性的过氧物酶活性后，经过99%的甲酸处理3分钟。再在5%正常血清TBS液中1小时阻断菲特异性结合（山羊血清对人血浆染色，马血清用于小鼠血浆染色）。人血浆或者小鼠血浆4℃下孵化过夜后，切片在亲和素结合的二抗中孵化，按照Vectastain Elite ABC试剂盒说明书进行信号扩大，最后在含0.03%双氧水的DAB溶液中显影。每次染色均设置Ab00）和漏加血浆分别加入阳性和阴性对照.
（表二 研究对象人口资料汇表）
4.3 TAPIR分级标准
&& 以Ab9204染色为阳性对照和漏加血清为阴性对照，根据每张连续切片中老年斑核心（SPC）染色深浅以及数量，将TAPIR分为4级：(1) 阴性（TAPIR-）：无阳性染色的SPC（图1F）；（2）弱阳性（TAPIR±），SPC淡染且数量少于5个（图1G）（3）阳性（TAPIR+）：5个以上的SPC被清晰染色（图1H）；（4）强阳性（TAPIR++）：大多数SPC被清晰染色（图1I）。阳性的弥散性斑、血管淀粉样改变，增殖或退化的神经元和神经胶质细胞都排除在上述分级标准之外。
4.4 &Aβ淀粉样蛋白（FAβ）的纯化
&& 一例通过病理尸检符合CERAD标准的AD患者大脑。大约2g的AD大脑灰质运用4体积的TBS液体（10mMTris,150mM Nacl, PH =8）和蛋白酶抑制剂（1 ug./ml亮肽酶素, 1 ug./ml TLCK, 0.1 ug./ml蛋白A，1mM EDTA）混合均匀后以100，000g离心1小时。再用10mL 的含有10%十二烷基硫酸钠（SDS）的TBS液体和1mL的99%的蚁酸抽提出沉淀物。悬浮液低压冻干后溶解于20ul的二甲基亚砜（DMSO），储存于-80°C的低温条件下直到使用（FAβ）。
4.5免疫沉降
20ul蛋白G琼脂糖和1ml的RIPA缓冲液（50mm Tris,1%Triton X-100,0.1%SDS,0.5%胆酸和150mm Nacl，PH8.0）冲洗3次，预洗的琼脂糖蛋白G分别与600ng的人工合成Aβ40，Aβ42或者300ngFAβ混合于1mlRIPA缓冲液后，并在常温下孵化30分钟，离心后将浮于上层的物质再次与20ul预洗琼脂糖蛋白G和10ul的血清混合并在常温下孵化3小时，再次离心，将沉淀物与1x Nupage含有0.1M二硫苏糖醇LDS样品缓冲液70°C加热10分钟，在4%-12%的Nupage Bis-Tris凝胶中电泳分离。转印迹和阻断非特异性结合后，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜在 4℃下与单克隆抗Aβ抗体(6E10)溶液摇荡过夜后，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG溶液室温孵育2h，最后在ECL溶液显色。
4.6 ELISA测量血浆Aβ40和Aβ42浓度
96微孔平板被单克隆的抗Aβ抗体-BNT77 (IgA, anti-Aβ11-28)预先包埋后，与100&l的血浆4℃下孵育24h，清洗后平板在4℃下与100&l的辣根过氧化酶标记的识别抗体：BA27（anti-Aβ1-40） 或 BC05 (anti-Aβ35-43)。人工合成的Aβ40和Aβ42 (含量分别为79.95%和76.58%，美国Sigma公司)被用作为标准Aβ。Aβ40 和Aβ42检测敏感度分别为40 fmol/ml和10 fmol/ml,批内偏差系数小于10%。
4.7数据分析
& 采用SPSS 11.0统计软件包和GraphPad Prism 4统计软件包。两组间比较采用Student T检验，Post-Hock方差分析或非参数检验比较各组数据，通过接收器工作曲线（ROS）分析测定的甄别阈，Mann–Whitney U检验检测TAPIR阳性率比较。
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发表于： 11:08
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施予本发明的任何抗体或多肽可通过本领域已知的任何方法来进行，包括：静脉内、皮下、通过吸入、动脉内、肌内、心脏内、心室内、非肠道、鞘内(intrathecally)和腹膜内施予。施予可以是全身性的(例如静脉内)或局部的。一般而言，这还适用于本发明的多肽和多核苷酸。在另一个方面，本发明还提供了包含本文所述的组合物中任何一种或多种的试剂盒和组合物，这些试剂盒通常被合适地包装，随同合适的说明书一起提供，它们可用于本文所述的任何方法。附图说明图1展示了9TL抗体重链可变区域(SEQ ID NO：1)和轻链可变区域(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。Kabat CDR以粗体表示，ChothiaCDR以下划线表示。重链和轻链可变区域的氨基酸残基按顺序编号。图2展示了通过肽竞争做出的抗体9TL的抗原决定簇图谱。Aβ1-40肽被固定到SA芯片上。单克隆抗体2289和9TL Fab片段(每种50nM)每种与10μM的多种肽(Aβ的28-40、1-40、1-28、28-42、22-35、1-16、1-43、33-40、1-38或17-40位氨基酸)或者在不加入肽的情况下预先温育1小时，然后流注到芯片上。测量抗体Fab片段与固定的Aβ1-40肽的结合。图3展示了通过肽竞争做出的抗体2H6的抗原决定簇图谱。Aβ1-40肽被固定到SA芯片上。单克隆抗体或2H6(每种100nM)每种与16μM的多种肽(Aβ的1-16、1-28、1-38、1-40、1-42、1-43、17-40、17-42、22-35、25-35或33-40位氨基酸)或者在不加入肽的情况下预先温育1小时，然后流注到芯片上。测量抗体与固定的Aβ1-40肽的结合。图4展示了抗体2H6、与不同Aβ肽C末端变体的结合。GST-Aβ变体(M35A、V36A、G37A、G38A、V39A或V40A)或GST-Aβ肽1-39、1-41、1-40、1-42被固定到ELISA板上。单克隆抗体或2289(每种mAb 0.3nM)与每种被固定的肽一起温育，通过与生物素化的抗小鼠IgG(H+L)进一步温育以及接着通过链亲合素-HRP来检测它们的结合。图5展示了用2H6和去糖基化2H6进行16周的抗体处理之后，APP转基因小鼠的空间认知缺陷被逆转。以两天版本的放射臂水迷宫来对小鼠进行测试。Y轴代表2天试验期发生错误的平均数目。组号(blocknumber)1-5代表第1天的测试；组号6-10代表第2天的测试。“*”表示：与抗AMN抗体处理的小鼠(A-AMN)相比较，对于2H6(A-2H6)和去糖基化的2H6(A-De-2H6)处理的小鼠而言，p＜0.05。“**”表示：与抗AMN抗体处理的小鼠(A-AMN)相比较，对于2H6(A-2H6)和去糖基化的2H6(A-De-2H6)处理的小鼠而言，p＜0.01。图6A和6B展示了用2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体进行16周抗体处理之后海马体(图6B)和前皮质(图6A)中实质Congo红染色的淀粉质beta肽的降低。图6A和6B中的Y轴代表Congo红染色阳性的平均百分比面积。图6A和6B中的X轴代表施予的抗体的类型。图7A和7B展示了用2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体进行16周抗体处理之后海马体(图7A)和前皮质(图7B)中血管Congo红染色的淀粉质beta肽的增加。图7A和7B中的Y轴代表Congo红染色阳性的平均百分比面积。图7A和7B中的X轴代表施予的抗体的类型。图8展示了用2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体进行16周抗体处理之后Prussian蓝阳性情况的数量。Y轴代表每部分的阳性情况。X轴代表施予的抗体的种类。图9展示了在APP Tg2576小鼠中施予2H6、抗AMN(称作AMN)以及去糖基化2H6(称为D-2H6)抗体之后，以及在野生型(WT)小鼠中施予抗AMN抗体和抗体2H6之后Aβ肽的血清水平。图10展示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中CD45的免疫染色。靠下的图展示了：颅内施予对照抗体、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的CD45阳性染色平均面积之比。“*”表示较之对照抗体，P＜0.01。图11展示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中Fcγ受体的免疫染色。靠下的图展示了：颅内施予对照抗体、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的Fcγ受体阳性染色平均面积之比。“**”表示较之对照抗体，P＜0.01。图12展示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中Aβ肽的免疫染色。靠下的图展示了：颅内施予对照抗体、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的Aβ肽阳性染色平均面积之比。“**”表示较之对照抗体，P＜0.01。“*”表示较之对照抗体，P＜0.05。图13显示了颅内施予2H6抗体(A)或去糖基化2H6抗体(B)之后小鼠海马体中的硫代黄素-S。靠下的图展示了：颅内施予对照抗体、、2H6抗体或去糖基化2H6抗体之后，前皮质和海马体中注射侧与未注射侧的硫代黄素-S阳性染色所占平均面积之比。“*”表示较之对照抗体，P＜0.05。图14展示了通过ELISA做出的抗体2294和6G的抗原决定簇图谱。多种Aβ肽被固定在ELISA板上。抗体与多种被固定的肽一起温育1小时。使用山羊抗人kappa HRP桥联的二抗来测量与被固定的Aβ肽结合的抗体6G。使用与重链和轻链结合且是HRP桥联二抗的山羊抗小鼠抗体来测量与被固定的Aβ肽结合的抗体2294。“NB”表示未检测到结合。“2294”和“6G”下，列中的数字代表450nm处的吸光率。发明详述本文公开的本发明提供了能与Aβ1-40的C末端结合的抗体和多肽。这些抚体或多肽从9TL或表3所示其变体获得。本发明还提供了制造和使用这些抗体的方法。在一些实施方式中，本发明提供了抗体9TL以及制造和使用该抗体的方法。本发明还提供了能结合Aβ1-40的9TL多肽(包括抗体)以及编码9TL抗体和/或多肽的多核苷酸。本文公开的本发明提供了预防和/或治疗个体中Aβ相关疾病的方法，所述疾病例如Alzheimer’s症、Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍、脑部淀粉质血管病、血管中Aβ肽沉积物导致的血管紊乱(例如中风和HCHWAD)，所述方法通过施予治疗有效量的抗体9TL或从9TL获得的抗体或多肽来进行。本发明还提供了预防和/或治疗个体中β淀粉质沉积物相关疾病的方法，所述疾病例如Alzheimer’s症、Down’s综合征、Parkinson’s症、多发梗塞性痴呆、轻度认知障碍和脑部淀粉质血管病，所述方法通过向所述个体施予有效量的药物组合物来进行，所述组合物包含特异结合β淀粉质肽或Aβ肽的聚集形式的抗体或多肽，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸，其中，所述抗体或多肽具有受损的效应器功能。普通技术
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