葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达
葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)是葡萄病毒危害中引起产量下降的主要病毒之一,一般罹病葡萄可致果穗松散,果粒变小,甜度降低,严重的可不结果,国内由于长期无性繁殖及近年来盲目引种导致果园内病毒病发生日趋严重,可使葡萄减产20%～80%。 GFLV属于蠕传多角病毒组(Nepovirus)。’,其基因组由两条线性正义单连RNA组成,组份1(RNAl)包含一个大的开放阅读框架(ORF),约7300多个核苷酸,负责编码具有病毒蛋白酶性质和RNA聚合酶功能的复合体,组份2(RNA2)约有3700多个核苷酸,也含有一个ORF,其编码产物经具蛋白酶功能的RNAl翻译产物剪切加工后形成病毒的外壳蛋白(Coat protein)。’。有的GFLV株系还含有一较小的卫星RNA,约由1100多个核苷酸组成。’。 我们从国内罹病葡萄中分离到了一株GFLV—Gh“’,通过RT—PCR(Reverse tran—scri...&
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葡萄卷叶病毒 (Grapevine leaf roll associated closterovirus,GL Ra V)是世界上危害葡萄生产的主要病毒病害 ,而且经常由多种病毒粒子复合侵染所致 ,GLRa V又没有局部枯斑寄主 ,难以对其进行分离和提纯。 90年代以来 ,随着提纯方法的改进和分子生物学技术的广泛应用 ,有关GLRa V的研究进展迅速。目前在 GLRa V的检测中已有 GLRa V不同株系的抗血清[1- 4] ,以及病毒 c DNA探针、双链 RNA等检测方法 [5,6]。GLRa V- 2、3均与黄化丝状病毒属 (Closterovirus)具有相似的基因结构。GLRa V- 3是由粉蚧传播的单基因组病毒 ,其分类地位独立于蚜虫传播的单基因组 Closterovirus以及粉虱传播的双基因组 Closterovirus病毒[7- 9] 。通过基因工程培育对GLRa V具有一定抗性的葡萄品种是提高葡萄对病毒抗性的...&
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北京地区葡萄扇叶病毒检测?晁无疾乜爱华周敏（北京农学院，１０２２０８）章德明（河北省果树研究所，０６６６００）摘要采用酶联免疫吸附技术（ＥＬＩＳＡ）（Ａ－蛋白夹心法）对北京地区的葡萄品种进行扇叶病毒（ｆａｎｌｅａｆｖｉｒｕｓ）的测定。结果表明，北京地区葡萄品种普遍感染扇叶病毒且带毒情况较为严重。关键词北京葡萄扇叶病毒在已报道的４３种葡萄病毒中，葡萄扇叶病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅｆａｎｌｅａｆｖｉｒｕｓ）是主要的病毒病之一，全世界葡萄产区均有发生。植株感染扇叶病毒后，弱病毒株系对葡萄的生长、结果影响不大，但强病毒株系则严重危害葡萄的生长与结果，使植株生长衰弱、果穗松散变小、落花落果严重且成熟期推迟、产量明显下降，一般减产２５％－３０％，严重时达８０％，果实品质变劣。在土壤浅薄、土温高和天气炎热的地区，甚至招致植株死亡。长期以来葡萄病毒病在我国并未引起足够的重视。葡萄多采用营养繁殖，而病毒传播的主要途径是插条和接穗，由于多年来缺乏严格...&
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葡萄扇叶病毒(GFV)是葡萄病毒中广泛传布和危害最大的病毒之一。近年来盲目引种使葡萄园内GFV危害只增不减。利用茎尖组织培养或结合热处理是选育脱GFV葡萄组培苗的有效方法,但要确认到底有没有真正脱除GFV还需经过检测,目前应用酶联免疫吸附试验(ELIsA)技术能可靠检测葡萄叶组织中的GFV,国外和我们的工作均表明检出GFV的最低浓度为10ng/ml。 本文报道一个新的试验方法即协同凝集试验。利用富含A蛋白的金黄色葡萄球菌(Sta-砂yzoco‘cu,a“r。,,)菌体上的A蛋白与特异抗体IgG分子的Fc段结合,使之菌体成为吸附抗体的载体,当与相应抗原接触时,抗原和抗体之间的特异性免疫反应互相连结而呈现凝集现象。 用高滴度的兔坑GFV血清标记金黄色葡萄球菌菌体。以LN一33(从美国引进脱GFV葡萄植株)葡萄叶组织的0.01mol/L磷酸缓冲液(声7.4)粗提液为阴性对照,LN一33健叶粗提液对提纯的GFV作系列稀释。标记菌体试剂与...&
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葡萄扇D-I’病毒(GraPevine Fanleafvirus,GFV)是危害葡萄的主要病毒之一。近年来由于盲目引种,缺乏严格的检疫手续和检测手段,使GFV的蔓延十分迅速,从日本引人的品种发病率高达80%以上‘’·2,。虽然用木本指示植物可以检测GFv,但检测时间长,如能建立快速、灵敏的GFV检测方法,则对检疫、抗病毒育种和脱病毒研究都有重要意义。 酶联免疫吸附试验(ELisA)是非常灵敏的病毒检测方法,国外报导用此法检测GFV取得较好效果‘5,。但他们均是采用双抗体夹心直接法(DAs一ELIsA),此法繁琐,株系检出率低。本文报导用两种简便、灵敏的间接ELIsA方法检测扇叶病毒的结果。 材料和方法 一、毒源和免疫试材 扇叶病毒毒源为澳大利亚的GFv一DIL和作者分离的Gx分离物‘”,在昆诺票(e方en叩。价:,m、:,i,:o‘,)上保存、繁殖,病毒提纯参考sa、ino等〔“,的方法加以改进。兔抗血清和小白鼠腹水抗体自制,部...&
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《病毒学》2010.7葡萄扇叶病毒本期封面上我们看到的是一串鲜嫩欲滴的葡萄……也许不全是!在诱人的葡萄中间还夹杂着一个伪装得很好的坏家伙,它就是我们今天的主角——葡萄扇叶病毒。世界上绝大部分的葡萄园都有葡萄扇叶病毒的存在,并经由剑线虫属的匕首线虫在葡萄植株之间传播。这个已知的最古老病毒可以使葡萄产量降低80%,破坏力极强。封面上隐藏在葡萄中的坏家伙就是使用计算机技术还原出来的葡萄扇叶病毒3D模型,它是一个由60个单元构成的近似20面体的结构。表面深蓝色的突起结构在病毒的传播过程中起到了重要作用。《分子细胞》2010.7缺氧反应当细胞面临着氧分压不足,即我们常说的缺氧环境时,一系列的基因就会发生改变,产生应答反应以适应恶劣的环境变化。来自首尔大学等单位的科研人员报道了这方面的研究进展,在缺氧环境下,细胞内一种名为G9a的转甲基酶启动,将染色质重组因子Reptin甲基化。这一缺氧变化驱动的Reptin甲基化改变继而推动了基因做出相应...&
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葡萄是果树中感染病毒病最多的树种之一 ,病毒种类多 ,分布广 ,危害大 ,受到世界各国的关注。截止 2 0 0 0年 ,世界各地的葡萄病毒病有 47种[1 ] 。葡萄卷叶病和葡萄扇叶病是分布最广泛 ,危害最严重的 2种葡萄病毒病害[2 ] 。由于不规范引种、频繁引种以及繁殖 ,导致多种葡萄病毒病迅速蔓延 ,严重威胁着葡萄的生产。病毒病的检测方法最早采用的是指示植物法 ,采用指示植物法检测葡萄病毒病需要培育大量的接种植物 ,费工费事 ,而且出现症状需要较长时间。Cadman等在1 960年首次将扇叶病毒向草本寄主转接获得成功后 ,世界许多国家便相继开展了扇叶病毒的血清学研究。血清学最早是从沉淀反应和凝胶扩散反应开始的 ,但这种方法灵敏度很低 ,且不能直接测定葡萄粗汁液中的病毒 ,仅能用于提纯或粗提纯病毒的鉴定和确定亲缘关系[3] 。 1 976年沃拉和克拉科等首次报道了将酶联免疫吸附测定法(Enzymelinkedimmunoso...&
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o调控母本基因的表达o参与可变剪接的调控，发挥着重要作用研究路线：_型鸭肝炎病毒的研究进展_文档下载
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_型鸭肝炎病毒的研究进展
专论与综述
Ⅰ型鸭肝炎病毒的研究进展
张宇辉１，甘一迪１，刘家森１，姜
骞１，司昌德１，曲连东１，黄鹤２
（１．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨１５０００１；２．黑龙江省疾病控制中心，１５００３０）
要：鸭病毒性肝炎是鸭的五大传染病之一，由于近年鸭肝炎（Ⅰ型）发病率的不断上升，以及变异株的不断出现，养鸭比较集中的地区都遭受了巨大的经济损失和严重的威胁。随着病毒基因组的测序的完成，为该病毒的研究有了一些新的认识和思路。本文从病毒的流行病学、基因组结构和功能以及病毒的检测方法等方面，阐述了ＤＨＶ－Ｉ的最新研究进展，为该病的防治提供理论基础。
（ＤＨＶ－Ｉ）关键词：Ⅰ型鸭病毒性肝炎；Ⅰ型鸭肝炎病毒
鸭病毒性肝炎（ＤＶＨ）是严重危害养鸭业的重要疫病之一。该病以传播迅速、高致死性、引起雏鸭出现肝炎及出血为主要特征。基于中和试验，ＤＨＶ被分为三个血清型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。而国内外主要流行Ｉ型及其变异株，且发病率和死亡率均呈上升趋势。为此，国内外学者对该病毒作了大量研究，尤其是在病原的检测方法及病毒的基因组结构上取得了突破性的进展。
病毒粒子呈二十面体对称，直径为２０￣４０ｎｍ，无囊膜，核心为单股正链的ＲＮＡ。Ｔｓｅｎｇ，Ｃ．－Ｈ．等测定的ＤＨＶ－Ｉ全基因组序列表明，整个基因组为约７６９０个核苷酸组成的单股正链（＋ｓｓＲＮＡ），编码２２４９个氨基酸，不含５’帽子结构，３’端ＲＮＡ
有ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴，只有一个较大的开放读码框（ＯＲＦ），即ＲＮＡ５’末端只含有一个翻译起始位点，病毒的ＲＮＡ指导合成一条完整蛋白，称为多聚蛋白（ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）。多聚蛋白在翻译过程中不断被自身编码的蛋白酶水解，分解成Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３产物，Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３又进一步分别分解为３个（ＶＰ０－ＶＰ４），３个（２Ａ－２Ｃ）和（３Ａ－３Ｄ）小片段蛋白。Ｐ１又称１ＡＢＣＤ，ＶＰ０、４个ＶＰ１和ＶＰ３相当于１ＡＢ、１Ｄ和１Ｃ，它们编码结构蛋白。Ｐ２和Ｐ３区编码非结构蛋白，Ｐ３区的３Ｃ和它的前体３ＣＤ在蛋白水解中发挥主要作用。３Ｄ编码ＲＮＡ聚合酶，参与病毒ＲＮＡ的复制，２Ｃ也可能参与ＲＮＡ的复制。２Ｂ与病毒的感染谱有关。３．１非编码区ＤＨＶ－Ｉ基因组ＲＮＡ的５’ＵＴＲ长约６２０ｎｔ，内含病毒翻译起始所必需的内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ），翻译的起始位点位于ｋｏｚａｋ序列（ＲＮＮＡＵＧＧ）中，其上游有一段嘧啶丰富区。小ＲＮＡ病毒ＩＲＥＳ元件的序列和二级结构在各病毒属不同血清型之间具有保守性，是病毒存活所必需的。根据病毒的序列相似性和结构同源性，小ＲＮＡ病毒的
１病毒的流行现状
１９５０年，Ｌｅｖｉｎｅ等首次分离到鸭肝炎病毒，目前呈世界
性分布。近年来，国内外学者相继报道了Ｉ型鸭肝炎病毒（ＤＨＶ－Ｉ）的变异情况，美国Ｓａｎｄｈｕ等利用鸡胚中和试验发现１株ＤＨＶ的变异株与ＤＨＶ－Ｉ呈部分交叉反应，仅有部分血清学相关性，命名为Ｉａ型（即Ｉ型抗血清可中和部分Ｉａ型病毒，但Ｉａ型抗血清对Ｉ型病毒缺乏中和作用）。自从郭玉璞等（１９８４）确定我国存在Ⅰ型以来，Ⅰ型一直是我国主要流行的血清型，但近年来，我国许多地区，也广泛流行一种Ⅰ型的变异株，这类变异株极似Ｓａｎｄｈｕ等（１９９２）提出的Ⅰａ型，但由于未能获得Ⅰａ型参考毒株，故郑献进（２００６）暂称之为Ⅰｖ型，是否与Ｉａ型具有抗原同一性尚有待考证。Ⅰ型及其变异
株在我国的广泛流行进一步加剧了控制该病的难度。
２病毒的分类地位
从形态学角度看，ＤＨＶ－Ⅰ与小ＲＮＡ病毒科的肠道病
毒类似，起初将其归为小ＲＮＡ病毒科（Ｐｉｃｏｒｎａｉｒｉｄａｅ）、肠道病毒属（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ），而ＩＣＴＶ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＴａｘｏｎ－
ｏｍｙｏｆＶｉｒｕｓｅｓ）在第八次分类报告中将其定为小ＲＮＡ病毒科的未定种。直至２００６年６月，Ｔｓｅｎｇ等测定了３株（ｓｔｒａｉｎＯ３０、ｓｔｒａｉｎＨ、ｓｔｒａｉｎ５８８６）ＤＨＶ－Ｉ全基因组序列，分析表明，ＤＨＶ－Ⅰ具有典型的小ＲＮＡ病毒的基因组结构特征，但又与其它小ＲＮＡ病毒的结构有差异：①ＤＨＶ－Ⅰ与其它小ＲＮＡ病毒的氨基酸序列一致性不超过３０％，保守的３Ｄ蛋白的氨基酸序列仅与ＬＶ和ＨＰｅＶ－１的一致性较高，分别为３８．６％和３６．６％；②ＤＨＶ－Ⅰ３’ＵＴＲ包括３１４ｎｔ，这在小ＲＮＡ病毒中是最长的；③ＤＨＶ－Ⅰ的结构蛋白ＶＰ０没有被蛋白酶水解为ＶＰ４和ＶＰ２；④ＤＨＶ－Ⅰ２Ａ基因由三个串联片断构成，２Ａ１、２Ａ２和２Ａ３。从遗传和进化角度分析显示ＤＨＶ－Ⅰ是小ＲＮＡ病毒的一个新的进化分支，由此Ｔｓｅｎｇ和Ｍｉｎ－ＣｈｕｌＫｉｍ等建议将ＤＨＶ－Ⅰ应归为小ＲＮＡ病毒科的
一个新病毒属，但还需对其基因组进行更深入的研究，才能确立其分类地位。
ＩＲＥＳ分为三型，Ⅰ型存在于肠道病毒属和鼻病毒属，心脏病毒属、口疮病毒属和双埃柯病毒属的ＩＲＥＳ属于Ⅱ型，甲肝病毒属的ＩＲＥＳ属于Ⅲ型。最近研究发现，部分小ＲＮＡ病毒的
端有一个保守的顺式作用元ＩＲＥＳ有相似的结构，ＩＲＥＳ的３’
件，基序为Ｙｎ－Ｘｍ－ＡＵＧ，其中Ｙｎ是一段嘧啶丰富区，Ｘｍ代表１５￣２５ｎｔ的间隔区，后面是起始密码子ＡＵＧ。在Ⅱ型ＩＲＥＳ中，ＡＵＧ是与４０ｓ核糖体亚基结合的起始密码子，在Ⅰ型ＩＲＥＳ中，４０ｓ亚基结合在ＡＵＧ下游３０－１５０ｎｔ处。ＤＨＶ－Ｉ的Ｙｎ－Ｘｍ－ＡＵＧ基序为Ｙ７－Ｘ６５－ＡＵＧ－ＣＡ－ＡＵＧ，由此６５ｎｔ的
间隔区和从核糖体结合位点到蛋白质合成起始位点之间的
３病毒的基因组结构及其功能
２ｎｔ，使得很难将ＤＨＶ－Ｉ的ＩＲＥＳ归为Ⅰ型或者Ⅱ型。但是预测其ＲＮＡ的二级结构表明，ＤＨＶ－Ｉ的５’ＵＴＲ可能含有Ⅱ型ＩＲＥＳ的颈环结构而没有Ⅰ型的三叶草结构，因此推断ＤＨＶ－Ｉ的５’ＵＴＲ区域会形成Ⅱ型的ＩＲＥＳ。
小ＲＮＡ病毒的３’ＵＴＲ通常很短，一般为４０￣２３７ｎｔ，ＤＨＶ－Ｉ的３’ＵＴＲ长为３１４￣３１７ｎｔ，这小ＲＮＡ病毒基因组中是最长的。目前已知的鸭小ＲＮＡ病毒基因组只有ＤＰＶ和ＤＨＶ－Ｉ，二者３’ＵＴＲ序列具有高度的一致性，并且比其他小ＲＮＡ病毒的３’ＵＴＲ都长。ＤＨＶ－Ｉ的３’ＵＴＲ可以形成５个发
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