为什么要用慢失活剂是自身失活慢病毒载体

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多少年来,如何治疗癌症,一直困扰着人类。不忍看着亲人痛苦地离去,人类作...  近几年来,慢病毒载体因其独特的优势,逐渐成为表达载体中的大热。慢病毒载体与其他表达载体相比,最大的优势是它们能感染分裂和非分裂的细胞。这对于众多干细胞和难转染细胞的研究者而言,可谓是一根及时的救命稻草,能解决令人头疼的转染效率低的问题。慢病毒(lentivirus)是反转录病毒的一种,需要相对较长的孵育时间,所以称之为“慢”病毒,lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括HIV、FIV(猫免疫缺陷病毒)和其他病毒。先来谈谈反转录病毒吧。反转录病毒是一类正链RNA病毒,分为顺式功能基因和反式功能基因。由于反转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白,能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别,并能介导反转录病毒的遗传物质高效进入宿主细胞内;并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合进宿主细胞染色体中,这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达;成熟的病毒颗粒以芽生的方式进入细胞培养液上清液中,易于和宿主细胞分离。但传统的反转录病毒载体没有组织特异性,只能感染处于分裂期的细胞,而且滴度低,并可能产生具有复制能力的反转录病毒,因此不能作为理想的表达载体。慢病毒病毒源于反转录病毒,但又有所不同。市场上的慢病毒是由人类免疫缺陷病毒(HIV),通过去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus)G糖蛋白(VSV-G)来代替HIV-1的包膜进行包装,从而更安全,宿主范围更广,还能增加病毒的滴度。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而实现持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,又很少引发机体的免疫反应,能达到良好的基因治疗效果,具有广阔的应用前景。如果你的实验需要长期基因表达或沉默,而目的细胞又很难转染,那慢病毒可以说是非常理想的选择。野生型的HIV大小约为9.8 kb,故插入片段一般在4-5 kb左右,这对于大部分的实验来说应该够用了。慢病毒载体的发展经历了3个阶段:第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表。在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离,分别构建在三个独立的质粒表达系统上,即包装质粒(一个强启动子如CMV作用下,控制除env以外所有病毒结构基因的表达)、包膜质粒(VSV-G基因)和载体质粒(目的基因),用这三种质粒共同转染包装细胞如人胚肾293T细胞,在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时,为了降低产生有复制能力的病毒的可能性,尽可能减少三种质粒之间的同源序列,但包装质粒中仍然保留了HIV的附属基因。第二代慢病毒载体系统是在第一代基础的改进,在包装质粒中删去了HIV的所有附属基因。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和转染能力,同时增加了载体的安全性。第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性:一是构建了自身失活的慢病毒载体,即删除了U3区的3’ LTR,使载体失去HIV-1增强子及启动子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA;二是去除了tat基因,代之以异源启动子序列,这样原始的HIV基因组中的9个基因在慢病毒载体中只保留了3个( gag、pol和rev) 。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。安全性始终是大家最关心的问题,毕竟是HIV改造过来的,不容许有一点闪失。国内的实验室很多都达不到P2的级别,甚至是一堆人挤在一个房间里做各种各样的实验。无论是为人为己考虑,慢病毒的安全性都应该特别关注。Clontech公司也是主张“安全第一”。它家的Lenti-X系统对广泛应用的第三代慢病毒做了改进,将pol基因与gag基因分离,这意味着要产生原始的病毒,还需要更多的重组步骤。完整的系统包含5个载体,安全性更高。慢病毒表达的一般流程如下:将目的基因片段克隆到表达载体上;将重组表达载体,与包装混合物(packaging mix,通常是几个质粒的混合)共转染293细胞;收集病毒上清,测定滴度;感染目的细胞,瞬时表达目的蛋白或用抗生素筛选稳定细胞株;分析目的蛋白。看上去并不复杂,但中间许多步骤需要不断优化。而且慢病毒有一个软肋,就是病毒滴度不高。你可能还需要纯化或浓缩,才能得到108 TU/ml的慢病毒。当然,各厂家也注意到了这个问题,不断改造慢病毒载体,使其滴度增加。具体的改造在下文中会一一介绍。市场上最为成熟的慢病毒表达载体主要来自两大表达巨头――Invitrogen和Clontech。Invitrogen就有十余种之多,而且名字都差不多,乍一看真是有点头晕。不过主要分为两大类,也就是第三代和第四代。所有的慢病毒表达载体都是pLenti命名,后面加上数字4、6、7,这些数字代表的是不同的筛选标记,4意味着用Zeocin筛选,6则是用Blasticidin筛选,7是带EmGFP的。很多系统都有两个版本,其实只是克隆方式的区别,一部分是采用Gateway同源重组的方式进行克隆的,另一部分则采用简便的5分钟TOPO克隆。ViraPower Lentiviral Expression System是最早的慢病毒表达系统,价格在17000元左右(20次)。系统中共涉及4个质粒:插入目的基因的pLenti表达载体,上面提供了ψ包装信号以及截短的HIV 3’及5’ LTR,便于病毒包装;pLP1质粒表达形成慢病毒结构所必需的gag基因以及病毒复制和整合必需的pol基因;pLP2质粒表达Rev蛋白,它能与pLP1上的反应元件(RRE)共同作用诱导Gag和Pol表达,并指导病毒RNA的核运输;pLP/VSVG表达水泡口炎病毒G糖蛋白(VSV-G),让宿主范围更广。这4个质粒必须共同作用,才能产生有感染能力的病毒粒子,缺一不可。最新推出的ViraPower HiPerform Lentiviral Expression System则是上述系统的升级版,从名字也可以猜个大概,HiPerform也就意味着High Performance嘛。它与上一个版本最主要的不同是表达载体上增加了两个新元件――WPRE和cPPT。WPRE来自土拨鼠肝炎病毒,放置在目的基因的上游,能加强转基因的表达。cPPT来自HIV-1整合酶基因,能增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数,从而使病毒滴度增加两倍。这两个元件共同作用,能使大多数细胞中的蛋白表达量至少增加4倍。其中有两个kit还称为FastTiter,因为它的载体含有EmGFP,能用流式细胞仪快速测定滴度。升级版的价格当然也会升级,估计在2万元以上。另外,还有一些特别的载体。比如说不带启动子的,可以让你检测某个启动子的活性;还有四环素诱导型的,能严格控制表达的时间。Invitrogen的慢病毒表达载体大抵就是这些,下面就是Clontech闪亮登场。Clontech的Lenti-X慢病毒表达载体与Invitrogen第四代的表达载体极为相似,有ψ包装信号和LTR,也有WPRE和cPPT两个元件。除了克隆方式(Clontech是采用酶切连接克隆)和筛选标记(Clontech用嘌呤霉素筛选)不同之外,这两家的载体几乎没什么区别,可能都是看了相同的文献受的启发吧。不过packaging mix就有一些区别了。Lenti-X HT包装系统利用了反式激活级联反应来高水平表达病毒蛋白,因此病毒滴度更高。HT即high Titers的缩写。一般来说,慢病毒表达的滴度约为105-106 TU/ml,而Clontech的滴度达到108 TU/ml。这就意味着你不必浓缩和纯化,就能直接感染细胞。不过需要特别注意的是,胎牛血清中常常含有四环素及其衍生物,会干扰反式激活反应,因此要特别订购不含四环素的FBS。Lenti-X系列还包含了荧光表达载体。你的目的蛋白可以在N端或C端融合AcGFP1(绿色)或DsRed(红色)荧光蛋白,这样就很容易观察到蛋白的表达和转运。四环素诱导表达本来就是Clontech的强项,Lenti-X系列当然也有可诱导表达的版本。慢病毒载体还在RNA干扰研究中发挥着巨大的潜能。慢病毒载体Sigma、Dharmacon、Invitrogen、Clontech公司都有,各有特色。Sigma公司的Mission TRC shRNA 慢病毒提供的是已经设计好、克隆并测序验证过、包装好的病毒颗粒,保证滴度达到106 TU/ml,实际滴度常大于107 TU/ml。买回来即可马上用于转导难对付的细胞,可谓超级方便。Mission TRC shRNA库是由麻省理工和哈佛等11个著名研究所及制药公司组成的RNAi联盟(The RNAi Consortium, TRC)的科学家共同研发的,其中包括靶向人类15000个基因对应的75000个shRNA克隆,以及小鼠15000个基因对应的75000个克隆。Mission慢病毒颗粒属于第三代,除了shRNA转移载体外,Packaging Mix中还含有两个质粒:包装载体提供必要的慢病毒基因,来形成病毒粒子的结构蛋白和包装功能;pCMV-VSV-G载体提供了包膜蛋白,让宿主范围更广。shRNA转移载体不仅表达shRNA,还提供了包装信号和顺式作用元件。它以U6为启动子,用G418进行筛选,或通过GFP发出的绿光来挑选。如果你的研究对象是人或小鼠的基因,Mission是再合适不过了。Dharmacon现在与和慢病毒载体的专业公司Lentigen合作,强强联手提供全方位的服务。你只需要提供基因的ID,Dharmacon就会帮你设计出shRNA,再由Lentigen合成,克隆到载体上并测序,转染包装细胞,收集、纯化并浓缩。送达你手上的就是滴度高于108 ifu/ml的病毒粒子,直接拿去感染细胞就OK了。不过具体实验前也需要摸索条件,包括感染复数(MOI)、细胞密度等。如果你对自己的实验技术很有信心,也不妨自己制备病毒粒子。Clontech的Lenti-X shRNA表达系统和上面的蛋白表达体统类似,不过启动子换成了U6。高效的Lenti-X HT包装系统对shRNA研究来说尤其有用。慢病毒的高转导效率,加上高的滴度,对基因沉默研究有着明显的优势。你原本想干扰每个细胞中的基因,但如果你只转导了50%的细胞,那就算你的shRNA非常棒,你的干扰效果也肯定不会好。这对非分裂细胞尤其重要,因为你本来就没有太多的克隆可供选择。Invitrogen的miRNA干扰载体与以上都不同,它是模拟体内microRNA的加工和干扰过程,所以载体上的启动子也与shRNA不同,用的是CMV,而不是U6或H1。CMV启动子的活性比U6、H1这些可强多了,因此干扰RNA的表达量更高,干扰效率自然也就更胜一筹。如果你不喜欢CMV,想换成组织特异的启动子,也没问题,可以用同源重组的方法将其替换。而且这个载体还有个特别的地方,就是它将几个干扰RNA串联起来,同时干扰2-3个基因。这样工作量可就大大减轻了。另外,这个载体现在也升级到第四代,病毒滴度更高。由于是新产品,中国的价格还暂未查到,不过估计在3万元左右,好货不便宜啊。尽管人们对基于H IV-1的慢病毒载体已经做了种种安全性结构改造,要产生有复制力的HIV,必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件。即便如此,基于AIDS的病源学基础仍然不能打消人们对于HIV的顾虑。这也意味着慢病毒载体要应用于临床,还有很长的路要走。(生物通 余亮)
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实验室有人操作二代慢病毒,在超净台操作,忘关风机,未戴口罩,将病毒液加入目的细胞中,约1小时,会怎样?如何补救?
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理论上,慢病毒需要生物安全柜保护操作者.实践上,管他呢,放开了抡
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我也差不多这么做了一回。吃了片维C吃了包板蓝根抗病毒,不知道会怎样。一年过了你现在怎样?
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没那么危险,不用太担心
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没那么危险的,它们只是遵照HIV的原理,并没有HIV的那种毒性。你想想要是真有HIV那种传染人的性质和毒性,那岂不是大家全都在做生化武器嘛
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这样做了一次,无任何防护,还开风机,现在还在担心自己,下个月准备去检查一下
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我一个同事他们在学校的时候从未用过生物安全柜,都是在普通超净台里进行慢病毒实验。
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应该对操作者没什么影响,还没有因为操作慢病毒而感染HIV的吧,不过实验操作还是要保持良好的习惯。第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时,为了降低产生有复制能力的病毒的可能性,尽可能减少三种质粒之间的同源序列,但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进,在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力,同时增加了载体的安全性。第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性:一是构建自身失活的慢病毒载体,即删除了U3区的′LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA;二是去除了tat基因,用异源启动子序列代替,这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。
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这种慢病毒是不是应该从属hiv的病毒属性,不会通过气溶胶经过呼吸道传播吧
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